使用串行块面和聚焦的Ion光束扫描电子显微镜进行有针对性的研究

任何生命科学项目，需要3D超结构调查一个特定的感兴趣的区域在复杂的生物样本可以利用这种技术。对于 SBF/SEM 和 FIB-SEM 这两种成像模式，样品制备过程是相同的。微波的使用大大加快了样品加工部件的速度。

尽管此处显示了根提示，但此协议可用于任何生物模型系统，只需最少的调整。在使用此工作流关联 SBF/SEM 和 FIB-SEM 之前，应熟悉各个技术。某些步骤的执行很容易证明，但很难用书面文字来描述。

演示该程序将是彼得·博格格拉夫谁是我们的实验室技术人员。首先，在阿加格板上切开固定阿拉伯沙皮西沙利安娜幼苗的根尖，并在四摄氏度下将两到三个尖在 Eppendorf 管中，在四摄氏度下过夜含有相同的固定性。早晨，用移液器，在管内用 pH 6.8 的 0.1 摩尔磷酸盐缓冲液代替固定剂，用 100 RPM 旋转的桌子上的管子更换固定剂，然后洗涤 10 分钟。

然后用新鲜的磷酸盐缓冲液重复洗涤五次。在烟气罩中，将磷酸盐缓冲液替换为 2%的三氧化二氮和 0.2%的红色，在 pH 6.8 的 pH 6.8 中，用带盖子的管子在微波炉中打开管，然后启动程序，从而修复根尖。然后将溶液丢弃在管子中，用双蒸馏水清洗根尖两次，每次五分钟。

对于第三和第四次双蒸馏水洗涤，使用微波炉协助洗涤。前 40 秒双蒸馏水洗涤后，从微波炉中抽取根尖样品，用新鲜的双蒸馏水代替双蒸馏水。将样品放回微波炉中并继续程序。

接下来，在15毫升管中加入0.1克硫化氢化物至10毫升双蒸馏水中，准备TCH溶液。将管子放入烤箱中，在60摄氏度下加热一小时溶解。然后使用 0.22 微米注射器过滤器过滤 TCH 溶液。

立即将样品管中的溶液替换为过滤的 TCH 溶液，然后继续执行协议。现在将样品浸入乙醇中，放入微波炉中，以50%70%90%的分级步骤脱水，然后进行两次100%乙醇处理。丙烯氧化物脱水处理后，将50%的S刺激树脂加入管中，开始渗透根尖至少两个小时。

在 100%Spurr 树脂中最终孵育后，将根尖放在嵌入模具中，用新鲜的 100% Spurr 树脂填充模具，并在 65 摄氏度的烤箱中聚合 36 至 48 小时。首先，使用剃须刀刀片将聚合样品大致修剪成薄块。当侧面有暴露的组织朝下时，将样品连接到金属销的中心，用导电环氧树脂使组织接触金属销。

将样品在65摄氏度的烤箱中，在一夜之间固化环氧树脂。早晨，将金属销装入托架，并使用剃须刀刀片清除样品中多余的环氧树脂。为了进一步平滑样品表面，请将托架与金属销一起装载，用于超微组。

在超微原子中，使用玻璃或钻石刀平滑形成金字塔的方块两侧表面。确保至少部分组织已经暴露在块面上。然后将修剪的样品块放在溅射涂布器中，并在 2 到 5 纳米处将设置调整为铂金，以用薄层覆盖样品。

将载体插入 SBF-SEM 显微镜中。将金刚石刀靠近样品表面，修剪样品的上部，以去除铂金层并露出部分组织。然后将加速电压设置为 1.5 至 2 千伏。

捕获组织的图像并设置成像运行。使用斐济软件，选择文件、导入、图像序列并定位图像堆栈以加载图像。根据手稿调整图像后，通过滚动浏览数据集来检查对齐方式。

使用文件菜单下的保存命令将对齐的数据集另存为 3D TIFF 文件。仔细分析数据集，看看是否包括 ROI，并包含生物问题所需的信息。在堆栈的最后一个图像（SBF-SEM 显微镜中的当前块面）上，为 FIB-SEM 选择新的 ROI。

再次涂上铂金后，将样品加载到 FIB-SEM 中，并使用 15 千伏的二次电子探测器和一个纳米放大器定位块面 SBF-SEM 中确定的 ROI。使用 FIB 梁和气体喷射系统移动和倾斜舞台，将样品上的 ROI 引入 FIB 和 SEM 光束的巧合点。将一微米保护层铂金沉积在 ROI 上方的表面上。

接下来，使用低铣削电流范围 50 至 100 皮安，在成像运行过程中将细线铣入铂沉积中，用于自动对焦和 3D 跟踪。然后使用 30 纳米安培的高铣削电流，在 ROI 前面铣削 30 微米的沟槽，为 SEM 光束创建成像表面。平滑图像表面后，开始成像运行，并在前 50 到 100 节期间监控过程的稳定性。

一旦系统平稳运行，离开房间，并确保房间内有尽可能少的干扰。SBF-SEM 的图像提供了组织的概述，从而深入了解了细胞的空间方向和细胞内连接。随后在新区域的 FIB-SEM 成像增加了特定细胞和结构的高分辨率细节。

SBF-SEM 数据显示了从等向体体素 FIB-SEM 数据中对非对等体体素的不同渲染。SBF-SEM 在表面上呈现楼梯效应，而具有五纳米截面的 FIB-SEM 数据可确保渲染看起来更平滑，单个截面完全融入表面。该协议描述了单个样本中唯一区域的成像，与工作流的任何偏差都可能导致样本损坏，因此无法重新定位感兴趣的区域。