非还原 SDS-PAGE 分析与化学交联相结合, 检测培养基细胞中的多物质配合物, 以确认培养中的多物质配合

已经证实，许多蛋白质的结构在共价二硫化物联系中稳定。在最近的工作中，这种结合被归类为翻译后修改。因此，使用快速简单的方法识别活细胞中的半胱氨酸稳定多体复合体非常重要。

该技术的主要优点是，可以快速、方便、以最低的成本获得和解释结果。首先，在最低必需中高血糖的六平方厘米培养皿中生长U-2 OS细胞，在37摄氏度（5%二氧化碳）中辅以10%FBS和1%丙酮酸钠。使用前，请重新储存10毫摩尔碘乙酰胺。

细胞达到50-60%汇合后，将0.1毫摩尔最终浓度最终浓度碘多乙酰胺直接添加到细胞培养基中。在室温下轻轻摇动盘子两分钟。接下来，从细胞中吸出介质，用五毫升的冷PBS洗涤三次。

吸走最终的PBS洗涤液，并加入一毫升的冷PBS。使用细胞刮刀将电池从盘子底部刮下来。使用一毫升移液器绘制PBS和细胞悬浮液，将所有液体分配到1.5毫升微离心管中。

在4摄氏度内旋转7，500次g的细胞，三分钟。吸气PBS留下细胞颗粒。细胞颗粒可以储存在零下80摄氏度，直到处理。

要提取蛋白质，请准备100微升在双蒸馏水中稀释的1X解液缓冲液。使用前立即添加 PMSF 至一毫摩尔最终浓度。然后将 1X 解液缓冲液的 50 微升直接添加到细胞颗粒中，然后重新悬浮。

在冰上孵育提取物五分钟。使用恒定脉冲模式在 40% 时使用声波 8 秒，将提取物保持在冰上。在摄氏四度和16，000次g下旋转提取物5分钟。

执行布拉德福德分析以确定蛋白质浓度，如果需要的话。制备样品，取10微升可溶性蛋白质提取物，并加入10微升1X莱姆利SDS样品缓冲液。把样品放在冰上。

在运行凝胶之前，在85摄氏度下加热样品5分钟。要开始甲醛交叉链接，在175平方厘米的烧瓶中生长U-2 OS细胞，达到70至80%的汇合率。在烟气罩中，将甲醛固定物直接添加到介质中，最终浓度为1%，并在室温下通过温和搅拌孵育15分钟。

淬火反应将1.25摩尔甘氨酸加入0.125摩尔的最终浓度，并在室温下孵育，在摇杆上轻轻搅拌5分钟。用五毫升的冷PBS洗三次细胞。吸走最终的PBS洗涤溶液，并加入10毫升的PBS。

使用细胞刮刀将电池从烧瓶底部刮下来。使用 10 毫升移液器绘制 PBS 和电池悬浮液，将所有液体分配到 15 毫升锥形离心管中。在500倍的g和4摄氏度的温度下旋转细胞两分钟。

吸气PBS留下细胞颗粒。通过添加 0.25 摩尔蔗糖、1 毫摩尔 EDTA、10 毫摩尔 HEPES 和 0.5%BSA（pH 7.4）来准备 10 毫升的均质缓冲液。使用前，立即将PMSF加入1毫摩尔最终浓度和三毫升核悬浮缓冲液中。

将五毫升的均质缓冲液直接加入细胞颗粒，然后完全重新暂停。将悬浮液在500倍g和4摄氏度下离心两分钟。离心后，丢弃上经剂，将颗粒重新在均质缓冲液的五毫升中。

然后用紧密的玻璃特氟龙均质器使细胞以每 500 RPM 10 冲程进行均质化，并在 1，500 倍 g 和 4 摄氏度下将悬浮液离空，持续 10 分钟。离心后丢弃上经剂。将颗粒重新悬浮在一毫升的核悬浮缓冲液中，并在冰上孵育10分钟。

孵育后，在600次g下离心10分钟。离心后，丢弃上流液，将颗粒重新悬浮在一毫升的核悬浮缓冲液中，然后再次离心。最后的颗粒将是分离的核。

提取蛋白质，如所述，然后将25微升的1X解液缓冲液直接加入到细胞颗粒中。然后为SDS PAGE准备两个样品，每次抽取10微升可溶性蛋白质提取物，并加入10微升2X莱姆利SDS样品缓冲液和1微升BME。在37摄氏度加热一个样品5分钟，在98摄氏度加热第二个样品15分钟，以扭转甲醛交叉链接。

通过混合 25 毫摩尔三酯、192 毫摩尔甘氨酸和每体积 SD 0.1% 的重量，准备一升 1X 三叶氨酸运行缓冲液。然后设置 SDS PAGE 运行设备。打开 16% 预制 TGX SDS-PAGE 封装，按照制造商的协议并取出盒式磁带。从盒式磁带底部拆下衬里井和胶带的梳子，将凝胶放入运行装置中。

用 1X 运行缓冲液填充腔室，直到油井浸入液体中。使用塑料移液器用运行缓冲液冲洗油井。将样品与预染色标准标记的 10 微升一起装载到凝胶上。

最后，以 200 伏电压运行凝胶，直到染料前部距离凝胶底部大约 1 厘米。在没有BME还原剂的情况下对总细胞提取物的西方印迹分析表明，不同人类细胞群的多美复合体形成。在检查的所有四个细胞系中，随着BME的添加，该复合物消失了，表明存在二硫化链接。

收获时人类细胞中dUTPase的单体确认是至少三种dUTPase等同形式的组合:线粒体等同形式、核等同形式和M24中指出的截断版本。用作对照的线粒体等形没有形成二硫化物链接，并迁移到单体蛋白的预测分子量。甲醛交核的交核表明多相复杂形成。

当交联在95摄氏度下孵育样品15分钟时，该复合物不稳定，可以在其单体状态下可视化。添加碘乙酰胺是此过程的重要步骤，用于阻止自由半胱氨酸残留物并确保二硫化物链接不是提取过程的结果。重要的是要记住，不要向 SDS-PAGE 样品添加任何还原剂，如 BME 或 DDT，因为这些将减少样品中存在的任何二硫化物链接。