该方法有助于回答肽合成领域的关键问题，如合成二硫化富肽并确定其相应的二硫化物桥模式。该技术的主要优点是，它允许选择性地合成不同的二硫化粘结肽异构体及其随后的化学和结构表征。通常，对这种方法的新鲜个体会挣扎，因为每种非硫化物丰富的肽的行为方式不同。
合成和分析可能需要针对单个肽或蛋白质进行部分优化。将文本协议中列出的试剂转移到相应的容器中，并放在固体相肽合成器的适当球拍中。然后，在反应柱中加入100毫克干树脂，并放入合成器的球拍中。
开始固相肽合成，详见文本协议。合成完成后，将树脂冻干过夜。现在从树脂中切出肽，对侧链进行深度保护。
为此，将干树脂混合在12毫升的管中，并在冰上冷却至零摄氏度。首先，加入150微升的清除剂混合物，然后每100毫克树脂加入1毫升95%三氟乙酸。在室温下，使混合物轻轻摇动三小时。
现在，通过玻璃褶皱过滤混合物。收集管中的滤气，单独填充冰冷二乙醚，每8至10毫升二乙醚的裂解混合物为一毫升。肽沉淀为白色固体。
如文本协议所述，冲洗和离心管后，冷冻干燥肽。为了用半制备色谱法净化线性前体，将约70毫克的粗肽加入15毫升管中。然后将粗肽溶解在0.1%TFA和一对一乙酰三叶酸水中。
在120分钟内，以每分钟10毫升的流速，使用0至50%的Eluent B梯度分离肽混合物。收集单个管中的分数，并准备选定的分数进行质谱法和 HPLC 分析，如文本协议中所述。冻结干燥分数并组合对等分数。
通过执行第一次氧化，开始选择性形成二硫化键。为此，将15毫克冻干线性肽溶解在105毫升异丙醇水混合物中。使混合物在基本条件下在空气中搅拌 12 至 48 小时。
逐步氧化过程非常关键。所有三个氧化步骤都采取反应控制，以确保单个二硫化物丰富的形成。第三次氧化是最关键的，因为当超过最佳反应时间时，可能发生二硫化物扰动。
现在执行第二次氧化。溶解15毫克冻干肽在105毫升异丙醇水，一个摩尔盐酸混合物。在甲醇中加入 158 微升 0.1 摩尔碘溶液。
在室温下搅拌反应，直到氧化完成。然后在水中加入79微升的摩尔抗坏血酸，从而停止反应。最后进行第三次氧化。
溶解15毫克的冻干肽在5.5毫升TFA含有清除剂混合物。将肽沉淀到含有冷二乙醚的管中，每八到十毫升二乙醚的反应是一毫升的反应溶液。在15毫克冷冻干燥的粗制植物中对15毫升管进行肽纯化。
使用 0.1%TFA 和一对一乙酰三叶酸的混合物将粗产品溶解在 HPLC 样品环的体积中。在涡流至完全溶解后，在3400倍G.下1分钟将溶液离心，将3.6毫升混合物放入5毫升注射器中，将样品注射至注射回路中，没有任何气泡。开始注入 HPLC 系统。
在120分钟内，以每分钟10毫升的流速，使用0至50%的Eluent B梯度净化肽混合物。收集单个管中的分数，因为它们出现。运行完成后，准备 MS 和 HPLC 分析的选定分数，如本文中所述。
冷冻干燥所有馏分，并储存在零下20摄氏度。要执行分析性 HPLC，请将肽馏分或反应对子的样品转移到 HPLC 小瓶中，将其溶解在 0.1%TFA 的混合物中，一对一乙酰三叶酸溶水。将 HPLC 小瓶放入分析反相 HPLC 设置的自动采样器中，以注入每个样品的 250 微升。
在水中使用 0.1%TFA 的梯度洗脱系统，在 Acetonitrile 中用作 0.1% TFA 中的 Eluent A。在 30 分钟内以每分钟 1.0 毫升的流速使用 10%至 40%Eluent B 的梯度分析肽。为了进行氨基酸分析，将100微克的纯肽转移到1.5毫升微离心管中，将粉末溶解在6摩尔HCL的200微升中。将溶液转移到玻璃安培后，用本森燃烧器火焰加热颈部，关闭安培。
然后将一个玻璃管放在一个加热块中，在110摄氏度的加热块中放置24小时，进行水解。24 小时后，打开安培并将溶液转移到两毫升微离心管中。在60摄氏度下将溶液离心6小时，在旋转真空浓缩器中离心210倍G。
然后将水解产品溶解在192微升的样品稀释缓冲液中，将溶液转移到微离心过滤器中。在2300次G下离心样品1分钟后，将100微升滤液转移到氨基酸分析样品管中。将管子放入氨基酸分析仪并开始分析。
在以往的还原协议中，必须采取若干反应控制，以获得两次或四次卡帕中甲基化物种，这是通过质谱法进行后续二硫化物分析所必不可缺少的。首先溶解600微克的纯肽在1.2毫升0.05摩尔柠檬酸盐缓冲液中，含有TCEP。在室温下孵育混合物，采集几个100微升反应控制样品，范围从零到30分钟。
将样品混合在1.5毫升微离心管中，与300微升烷基化缓冲液，以停止反应，并执行无硫醇组碳基甲基化。五分钟后停止反应，加入100微升10%TFA和水，将样品储存在干冰上。现在，对示例执行 HPLC，如文本协议中详细说明的。
将少量收集的馏分转移到1.5毫升微离心管中，用于氧化形式的MS/MS分析。将剩余的肽溶解在水中0.1%TFA中，并在100毫摩尔TCEP溶液中加入适当的体积，以获得10毫摩尔的最终TCEP浓度。此时，可以通过肽测序检查选择性半胱氨酸烷化。
在中间的两个肽中，可以确定二硫化桥型。对不同的异构体进行NNR分析，以揭示单个肽结构。显示了20个能量最低的结构以及不同异构体的二硫化连接。
值得注意的是，需要将反相 HPLC MS/MS 碎片和 NMR 分析相结合，以明确识别二硫化连接。根均方偏差值的比较表明，刚性肽主要导致更好的核化 NMR 结构。本视频应为您提供一个示例，了解如何选择性地合成具有所需二硫化键模式的肽。
它还显示通过招标质谱法检查正确的二硫化物连接性，通过 NMR 光谱法获得三维结构的可能性。该技术开发后，为肽合成领域的研究人员探索二硫化键模式对三维结构的重要性以及由此产生的肽异构体的活性铺平了道路。按照这个程序，可以执行其他方法，如活动ASAS，以便深入了解不同肽异构体在特定生物靶点的结构活性关系。
虽然这种方法可以提供对康多毒素的合成和分析的见解，它也可以应用于其他二硫化桥肽和蛋白质，如芬森、富含二硫化物的动物毒素和其他含有分子的多种半胱氨酸。
