È stato ben stabilito che le strutture di molte proteine sono stabilizzate in collegamenti covalenti disolfuro. In recenti lavori questo legame è stato classificato come una modifica post-traslazione. Pertanto, è importante essere in grado di identificare complessi multimeri stabilizzati dalla cisteina nelle cellule viventi utilizzando un metodo rapido e semplice.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che i risultati possono essere ottenuti e interpretati rapidamente, facilmente e con il minimo costo. Per iniziare, far crescere le cellule del sistema operativo U-2 in un piatto di sei centimetri quadrati in Minimum Essential Medium High Glucose, integrato con 10%FBS e 1%piruvato di sodio a 37 gradi Celsius in 5% di anidride carbonica. Fare uno stock fresco di iodoacetamide da 10 millimolare appena prima dell'uso.
Dopo che le cellule hanno raggiunto il 50-60% di confluenza, aggiungere 0,1 millimolare la concentrazione finale iodoacetamide direttamente al supporto di coltura cellulare. Scuotere delicatamente il piatto a temperatura ambiente per due minuti. Successivamente, aspirare il supporto dalle cellule e lavare le cellule con cinque millilitri di PBS freddo tre volte.
Aspirare la soluzione di lavaggio PBS finale e aggiungere un millilitri di PBS freddo. Raschiare le cellule dal fondo del piatto usando un raschietto per cellule. Utilizzando una pipetta da un millilitro, redigere il PBS e la sospensione cellulare e erogare tutto il liquido in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.
Ruotare le cellule a 7.500 volte g in quattro gradi Celsius per tre minuti. Aspirare il PBS lasciandosi alle spalle il pellet cellulare. Il pellet di cella può essere conservato a meno 80 gradi Celsius fino alla lavorazione.
Per estrarre la proteina, preparare 100 microlitri di un tampone di lysis 1X diluito in acqua doppia distillata. Aggiungere il PMSF immediatamente prima dell'uso a una concentrazione finale millimolare. Quindi aggiungere 50 microlitri del tampone di lisi 1X direttamente al pellet cellulare e sospendere di nuovo.
Incubare l'estratto sul ghiaccio per cinque minuti. Sonicare per otto secondi utilizzando la modalità impulso costante al 40% mantenendo l'estratto sul ghiaccio. Ruotare l'estratto a quattro gradi Celsius e 16.000 volte g per cinque minuti.
Eseguire l'analisi di Bradford per determinare la concentrazione proteica, se lo si desidera. Per preparare il campione prendere 10 microlitri dell'estratto proteico solubile e aggiungere 10 microlitri di un tampone campione 1X Laemmli SDS. Tieni i campioni sul ghiaccio.
Scaldare il campione a 85 gradi Celsius per cinque minuti prima di eseguire il gel. Per iniziare il cross-linking della formaldeide, far crescere le cellule del sistema operativo U-2 in un pallone da 175 centimetri quadrati al 70-80% di confluenza. In una cappa aspirante aggiungere la formaldeide fissativa direttamente al mezzo ad una concentrazione finale dell'1% e incubare a temperatura ambiente con agitazione delicata per 15 minuti.
Per spegnere la reazione aggiungere 1,25 glicina molare ad una concentrazione finale di 0,125 molare e incubare a temperatura ambiente con delicata agitazione su un rocker per cinque minuti. Lavare le cellule con cinque millilitri di PBS freddo tre volte. Aspirare la soluzione di lavaggio PBS finale e aggiungere 10 millilitri di PBS.
Raschiare le cellule dal fondo del pallone usando un raschietto per cellule. Utilizzando una pipetta da 10 millilitri, redigere il PBS e la sospensione cellulare e erogare tutto il liquido in un tubo di centrifuga conico da 15 millilitri. Ruotare le cellule a 500 volte g e quattro gradi Celsius per due minuti.
Aspirare il PBS lasciandosi alle spalle il pellet cellulare. Preparare 10 millilitri del tampone di omogeneizzazione aggiungendo 0,25 saccarosio molare, un EDTA millimolare, 10 HEPES millimolare e 0,5%BSA a pH 7,4. Immediatamente prima dell'uso, aggiungere PMSF a una concentrazione finale millimolare e tre millilitri del tampone di sospensione dei nuclei.
Aggiungere cinque millilitri del tampone di omogeneizzazione direttamente al pellet cellulare e rimospendare completamente. Centrifugare la sospensione a 500 volte g e quattro gradi Celsius per due minuti. Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante e rimescolare il pellet in cinque millilitri del tampone di omogeneizzazione.
Quindi con un omogeneizzatore in teflon in vetro aderente omogeneizzare le cellule a 10 colpi per 500 giri/min e centrifugare la sospensione a 1,500 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Dopo la centrifugazione scartare il supernatante. Resuspend il pellet in un millilitro del tampone di sospensione dei nuclei e incubare sul ghiaccio per 10 minuti.
Dopo l'incubazione, centrifugare a 600 volte g per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante, rimescolare il pellet in un millilitro del tampone di sospensione dei nuclei e centrifugare di nuovo. Il pellet finale saranno i nuclei isolati.
Estrarre le proteine come descritto prima di aggiungere 25 microlitri del tampone di lisi 1X direttamente al pellet cellulare. Quindi preparare due campioni per SDS PAGE prelevando 10 microlitri ciascuno dell'estratto proteico solubile e aggiungere 10 microlitri di tampone campione 2X Laemmli SDS e un microlitri di BME. Riscaldare un campione a 37 gradi Celsius per cinque minuti e il secondo campione a 98 gradi Celsius per 15 minuti per invertire il collegamento incrociato della formaldeide.
Preparare un litro di tampone di corsa tris-glicina 1X mescolando tris millimolare, 192 millimolare glicina e 0,1% di peso per volume SD. Quindi impostare l'apparecchio di funzionamento SDS PAGE. Aprire il pacchetto TGX SDS-PAGE prefabbricato del 16% in base al protocollo del produttore e rimuovere la cassetta. Rimuovere il pettine che rivestono i pozzi e il nastro dal fondo della cassetta e posizionare il gel nell'apparato in esecuzione.
Riempire la camera con il tampone di corsa 1X fino a quando i pozzi non sono immersi nel liquido. L'uso di una pipetta di plastica risciacqua i pozzi con tampone di corsa. Caricare i campioni sul gel insieme a 10 microlitri del marcatore standard pre-macchiato.
Infine, eseguire il gel a 200 volt fino a quando la parte anteriore del colorante è a circa un centimetro dal fondo del gel. Un'analisi western degli estratti totali di cellule in assenza di agente riducente del BME ha dimostrato una formazione complessa multimerica in diverse popolazioni di cellule umane. Il complesso scomparve con l'aggiunta di BME in tutte e quattro le linee cellulari esaminate, indicando la presenza di un collegamento disolfuro.
La conferma monomerica della dUTPasi nelle cellule umane al momento della raccolta è una combinazione di almeno tre delle isoforme della dUTPasi:l'isoforma mitocondriale, l'isoforma nucleare e una versione troncata notata a M24. L'isoforma mitocondriale usata come controllo non formava un legame disolfuro e migrava al peso molecolare previsto per la proteina monomerica. Il cross-linking della formaldeide della dUTPasi nucleare ha dimostrato una formazione complessa multimerica.
Quando il collegamento incrociato è stato invertito incubando il campione a 95 gradi Celsius per 15 minuti, il complesso è stato destabilizzato e potrebbe essere visualizzato nel suo stato monomerico. L'aggiunta di iodoacetamide è un passo importante in questa procedura per bloccare i residui liberi di cisteina e per garantire che i collegamenti disolfuro non siano una conseguenza della procedura di estrazione. È importante ricordare di non aggiungere alcun agente riducente, ad esempio BME o DDT ai campioni SDS-PAGE in quanto questi ridurranno eventuali collegamenti disolfuro presenti nel campione.
