Было хорошо установлено, что структуры многих белков стабилизируются в ковалентных дисульфидных связях. В недавней работе эта связь была классифицирована как пост-переводная модификация. Таким образом, важно уметь выявлять мультимерные комплексы цистеин в живых клетках, используя быстрый и простой метод.
Основным преимуществом этой техники является то, что результаты могут быть получены и интерпретированы быстро, легко и с минимальными затратами. Для начала вырастите клетки ОС U-2 в шести квадратных сантиметрах тарелки в minimum Essential Medium High Glucose, дополненной 10%FBS и 1%sodium pyruvate при 37 градусах Цельсия в 5%углекислом газе. Сделайте свежий запас 10 миллимолярского идоацетамида непосредственно перед использованием.
После того, как клетки достигают 50 до 60% слияния, добавьте 0,1 миллимоляра конечной концентрации иодоацетамида непосредственно в средствах массовой информации клеточной культуры. Аккуратно раскачивайте блюдо при комнатной температуре в течение двух минут. Далее, аспирировать средства массовой информации из клеток, и мыть клетки с пятью миллилитров холодного PBS в три раза.
Аспирировать окончательный раствор PBS мыть, и добавить один миллилитров холодного PBS. Очисти клетки от нижней части блюда с помощью клеточного скребка. С помощью одноми миллилитров пипетки составить PBS и клеточной подвески и обойтись всей жидкостью в 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку.
Спин клетки на 7500 раз г в четыре градуса по Цельсию в течение трех минут. Аспирировать PBS оставляя ячейки гранулы позади. Ячейка гранулы могут храниться при температуре минус 80 градусов по Цельсию до обработки.
Для извлечения белка приготовьте 100 микролитров буфера лиза 1X, разбавленного двойной дистиллированной водой. Добавьте PMSF непосредственно перед использованием в одну миллимолярдную окончательную концентрацию. Затем добавьте 50 микролитров буфера 1X лиза непосредственно к грануле клетки и повторно приостанавливайте.
Инкубировать экстракт на льду в течение пяти минут. Sonicate в течение восьми секунд, используя режим постоянного импульса на 40%сохраняя экстракт на льду. Спин экстракт при четырех градусах по Цельсию и 16000 раз г в течение пяти минут.
Выполните брэдфордский анализ, чтобы определить концентрацию белка при желании. Для подготовки образца возьмите 10 микролитров растворимого белкового экстракта и добавьте 10 микролитров буфера образца 1X Laemmli SDS. Храните образцы на льду.
Нагрейте образец при температуре 85 градусов по Цельсию в течение пяти минут перед запуском геля. Чтобы начать перекрестную связь формальдегида, вырастите ячейки ОС U-2 в колбе площадью 175 квадратных сантиметров до 70-80%. В паровой капюшон добавить формальдегид фиксатор непосредственно к среде до конечной концентрации 1% и инкубировать при комнатной температуре с нежным возбуждением в течение 15 минут.
Для утоления реакции добавьте 1,25 молярного глицина к окончательной концентрации 0,125 молара и инкубировать при комнатной температуре с нежным возбуждением на рокере в течение пяти минут. Вымойте клетки с пятью миллилитров холодного PBS три раза. Аспирировать окончательный раствор PBS мыть и добавить 10 миллилитров PBS.
Очисти клетки от нижней части колбы с помощью клеточного скребка. С помощью 10-миллилитровой пипетки составить PBS и клеточной подвески и обойтись всей жидкости в 15-миллилитровый конической центрифуги трубки. Спин клеток на 500 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение двух минут.
Аспирировать PBS оставляя ячейки гранулы позади. Подготовьте 10 миллилитров буфера гомогенизации, добавив 0,25 молярной сахарозы, один миллимолярный ЭДТА, 10 миллимолейных HEPES и 0,5%BSA при рН 7,4. Непосредственно перед использованием добавьте PMSF в одну миллимолярдную окончательную концентрацию и три миллилитров буфера подвески ядер.
Добавьте пять миллилитров буфера гомогенизации непосредственно к клеточной грануле и полностью потух. Центрифуга подвески при 500 раз g и 4 градусах Цельсия в течение двух минут. После центрифугации отбросьте супернатант и повторно посовелите гранулы в пять миллилитров буфера гомогенизации.
Затем с плотной установки стекла тефлоновый гомогенизатор dounce гомогенизировать клетки при 10 ударов на 500 об /мин и центрифуги подвески на 1500 раз g и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут. После центрифугации откажитесь от супернатанта. Повторно посовестью гранулы в один миллилитр буфера подвески ядер и инкубировать на льду в течение 10 минут.
После инкубации центрифугу 600 раз г в течение 10 минут. После центрифугации, отбросьте супернатант, повторно посовелите гранулы в один миллилитр буфера подвески ядер и центрифугу снова. Окончательный гранулы будут изолированные ядра.
Извлекайте белки, как описано, прежде чем добавить 25 микролитров буфера 1X лиза непосредственно к клеточной грануле. Затем подготовьте два образца для SDS PAGE, взяв по 10 микролитров каждого растворимого белкового экстракта и добавьте 10 микролитров буфера образца 2X Laemmli SDS и один микролитер BME. Нагрейте один образец при температуре 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут, а второй образец при температуре 98 градусов по Цельсию в течение 15 минут, чтобы обратить вспять перекрестную связь формальдегида.
Подготовьте один литр буфера 1X Tris-glycine, смешивая 25 миллимолярдных три, 192 миллимолярдных глицина и 0,1% веса на объем SD. Затем на настройку работает аппарат SDS PAGE. Откройте 16%precast TGX SDS-PAGE пакет в протоколе производителя и удалите кассету. Снимите гребень, который выстилает колодцы и ленту, со дна кассеты и поместите гель в работающий аппарат.
Заполните камеру 1X бегущим буфером до тех пор, пока скважины не будут погружены в жидкость. С помощью пластиковой пипетки промыть скважины с помощью бегущего буфера. Загрузите образцы на гель вместе с 10 микролитров предварительно окрашенных стандартных маркеров.
Наконец, запустить гель на 200 вольт, пока краситель фронт составляет примерно один сантиметр от нижней части геля. Западный анализ помарки всего выдержки клетки в отсутствии агента уменьшения BME продемонстрировал multimeric сложное образование в по-разному людских населенностях клетки. Комплекс исчез с добавлением BME во всех четырех исследованных клеточных линиях, что указывает на наличие дисульфидной связи.
Мономерным подтверждением dUTPase в клетках человека во время сбора урожая является сочетание по крайней мере трех изоформ dUTPase: митохондриальной изоформы, ядерной изоформы, и усеченной версии отметил на M24. Митохондриальная изоформа, используемая в качестве контроля, не создала дисульфидной связи и мигрировала к прогнозируемому молекулярному весу мономерного белка. Формальдегидные перекрестные соединения ядерного dUTPase продемонстрировали многомерное сложное образование.
Когда перекрестная связь была обращена вспять путем инкубации образца при 95 градусах по Цельсию в течение 15 минут, комплекс был дестабилизирован и мог быть визуализирован в его мономерное состояние. Добавление иодоацетамида является важным шагом в этой процедуре, чтобы блокировать свободные остатки цистеин и обеспечить, чтобы дисульфидные связи не являются следствием процедуры извлечения. Важно помнить, чтобы не добавлять какой-либо уменьшаемый агент, такой как BME или DDT, в образцы SDS-PAGE, поскольку это уменьшит любые дисульфидные связи, присутствующие в вашем образце.
