1 类组蛋白除乙酰酶，如 Rpda 被讨论为治疗真菌感染的潜在新目标。然而，纯化酶活性是进一步表征需要。该协议的主要优点是快速和充分分离本机 TAP 标记复合体，只需一步即可确定活动。
从该协议中提取的HDAC复合物可用于新型真菌特异性脱乳酶抑制剂的功效筛选。该方法为TATA标记真菌蛋白的提取和纯化提供了依据，可作为建立其他酶和菌株协议的起点。要开始此过程，请将 10 毫升 CSS 添加到每个准备好的康尼迪亚瓶中。
用提供的螺钉盖紧密合上每个烧瓶，并大力摇动。在此之后，使用无菌接种循环完全刮掉任何剩余的锥形。通过放置在离心管上的 40 微米细胞过滤器将锥形分离器，然后将悬浮瓶的五个烧瓶收集到一个管中。
然后将样品离心，以结合和稀释文本协议中概述的样品。首先将奶酪布放入烧瓶顶部的漏斗中。通过布过滤准备好的 mycelia，用去化水短暂清洗。
通过将奶酪布挤压在双手之间，然后在纸巾之间，从 mycelia 中去除尽可能多的水分。在此之后，将干燥的 mycelia 作为平板转移到带螺丝盖的塑料烧杯中。使用液氮，在冻干之前将米西莉亚闪冻并储存在零下80摄氏度。
然后一夜之间冻干我的西莉亚。第二天，当米西莉亚的温度保持不变时，停止冷冻干燥过程。拆下烧杯，并立即用提供的螺钉盖密封。
首先将1.5克的米西莉亚和研磨球加入球磨机的研磨罐中。以 25 赫兹研磨米塞利粉末 30 秒，然后将米塞利粉末转移到 15 毫升离心管中。倾斜管，允许随后将麦芽糖与缓冲液混合，然后加入6毫升的冰冷萃取缓冲液B250，包括1X蛋白酶抑制剂鸡尾酒，每克麦芽糖粉，与一个小铲混合，直到实现原油提取物完全均质;将管子在冰上保持5分钟。
接下来，将管子和平衡管放入离心机中，以4万次g和4摄氏度旋转，至少20分钟。在离心过程中，设置一个 10 毫升的一次性色谱柱，开始平衡 IgG 树脂。将很好地重新暂停的IgG树脂移液 300 微升进入柱。
用 B250 填充柱到 10 毫升，让缓冲液通过重力流过。加入一毫升B250，包括1X蛋白酶抑制剂鸡尾酒，让它流过，然后插入柱的底部。离心后，取出10微升的上经剂进行SDS-PAGE分析。
将样品放入含有 40 微升水和 12.5 微升 5X LSB 的 1.5 毫升管中。使用血清移液器，小心地取出上流液，并将其转移到包含平衡的 IgG 珠子的柱上。通过紧密固定提供的端盖来关闭柱。
首先，在转速为 10 rpm 和 4 摄氏度的旋转混合器上孵育色谱柱，持续 2 到 4 小时。在此之后，取下盖子并打开底部的列以收集流经。要清洗柱，请使用管道将一毫升洗涤缓冲液 250 添加到柱盖中，以去除任何受困的珠子，并将该悬浮液一次冲刷到已结算的树脂上以重新悬浮珠子。
然后用洗涤缓冲液 250 填充柱子，并使用连接到近位泵的堆叠盖关闭。启动近光泵，将泵调整到每分钟约 1 到 5 毫升的流速，重复此洗涤过程，总共进行四次洗涤，然后使用 TEV 平衡缓冲液重复此洗涤过程三次。关闭底部的色谱柱。
将IgG珠子重新填充在一毫升的TEV裂解缓冲液中，加入20微升50X蛋白酶抑制剂鸡尾酒以及10微升的TEV。接下来，在转速为 10 rpm 的旋转混合器上孵育，并在 4 摄氏度的温度下孵育通过标记的 HDAC 将蛋白质复合物与标记的 HDAC 结合。第二天，打开柱子，在两毫升离心管中收集水线。
使用 0.7 毫升 TEV 裂解缓冲液从盖子上取下珠子并冲洗柱壁。将两毫升离心管放入 50 毫升离心管中，然后将柱放在打开的两毫升管上。将整个组件转移到台式离心机上，以 300 倍 g 旋转两分钟，以获得 TEV Eluate。
在这项研究中，从丝质真菌阿斯珀吉卢斯尼杜兰对TAP标记的1类HDAC进行单步浓缩，用于评估体外脱乳酶活性。这一典型结果清楚地说明了第一个关联步骤的功效，在执行串联纯化时，这种作用进一步增强。然而，蛋白质提取物和流经中存在的大多数突出蛋白质已经在TEV Eluate中耗尽。
免疫blot显示强信号以大约 120 千吨方向迁移，这些强信号与 TEV Eluate 中 CBP 标记的全长 RpdA 对应，即平静杜林流经和 Eluate 分数。此处显示了与特定 HDAC 抑制剂 Trichostatin A 具有代表性的脱乳基酶活性测定。活性的灵敏度确认测量值是由于RpdA引起的，而不是由非特异性蛋白酶活性引起的。
这一点很重要，因为它表明，TEV蛋白酶，这是在相当高浓度存在，不干扰HDAC活性测定。有趣的是，与 TEV Eluate 相比，在第二个亲和力纯化步骤 CE 之后，HDAC 活性显著减少。为了允许有效的蛋白质提取，确保米西莉亚是地面细粉。
当没有机器可用且砂浆和砂浆用于研磨时，这一点尤其重要。在协议中加入第二个亲和力步骤，结果分数足够纯，足以识别蛋白质，但在质谱仪上完成。使用液氮时，请务必戴上安全护目镜和防护手套，以免人身伤害。
