离体 聚乙烯醇基培养物中小鼠造血干细胞的扩增和遗传操作

该协议允许功能性小鼠造血干细胞的扩增和遗传操作，从而更深入地了解造血干细胞生物学和造血。该技术的优点是它可以支持造血干细胞进行长期离体培养，并允许遗传操作来询问造血的遗传学。该培养系统为造血干细胞生物学和造血的各种研究提供了平台技术，包括遗传、分子和生化研究。

疑难解答表列出了使用此技术遇到的常见难题的原因和解决方案。展示如何正确提取骨髓细胞并进行完整的培养基更换比阅读它要容易得多，也更有效。要开始造血干细胞或HSC提取，请使用不起毛的精致工作湿巾清洁从适当安乐死的小鼠中新鲜分离的骨骼。

从骨骼中去除肌肉和脊髓，然后将它们添加到含有约三毫升PBS的研钵中。使用杵将骨头压碎而不研磨，以尽量减少剪切力。然后，使用连接到5毫升注射器的19号针头，分解释放到PBS中的大骨髓碎片，并通过70微米过滤器将悬浮液转移到50毫升锥形管中。

转移悬浮液后，用新鲜的PBS重复该过程，直到骨骼漂白。目标是每只小鼠的最终体积约为30毫升，两只小鼠的最终体积为50毫升，以漂白骨骼，直到看不到更多的骨髓。通过将磁性过滤柱放入磁性柱分离器的磁铁中来准备色谱柱富集，顶部有一个 50 微米的过滤器，下面有一个 15 毫升的锥形管。

接下来，用别藻蓝蛋白抗c-Kit抗体和别藻蓝蛋白磁性微珠处理细胞后，通过50微米过滤器和过滤柱运行三毫升无菌PBS。一旦PBS通过，将细胞悬液通过色谱柱，然后每次洗涤三次三毫升冷PBS。每次洗涤后，等待色谱柱停止滴落，然后再添加PBS进行下一次洗涤。

接下来，从磁铁上取下色谱柱并将其放在新鲜的15毫升管顶部，并在色谱柱中加入5毫升冷PBS，然后将色谱柱塞安装到其上并通过推动柱塞洗脱细胞。按照文中描述的方案制备足够的HSC培养基，用于所需数量的细胞或孔，以每毫升接种0.5至100万个细胞。然后旋转富含c-Kit的造血干细胞和祖细胞或HSPC，并以所需的细胞密度将沉淀重悬于新鲜制备的HSC培养基中。

将细胞转移到纤连蛋白包被或负表面带电的板上，保持适当的体积。将细胞置于37摄氏度和5%二氧化碳的组织培养箱中。在不干扰细胞培养物的情况下从组织培养箱中轻轻取出板后，使用移液器或真空泵从每个孔的液体弯月面中缓慢吸出约90%至95%的培养基。

避免从孔底部抽取培养基。然后将一毫升预热至37摄氏度的新鲜培养基加入孔中。将板放回组织培养箱，每两到三天更换一次培养基，直到实验需要。

将细胞重悬于核转染缓冲液中后，立即将细胞悬液转移到含有络合核糖核蛋白的PCR管中，并通过缓慢上下移液轻轻混合。现在非常缓慢地将混合物转移到适当体积的电穿孔比色皿中，保持连续的流体运动，以避免在比色皿内形成气泡。然后，在电穿孔机上，选择被电穿孔孔的位置。

使用触摸屏，选择细胞类型程序为 CD34 阳性人或输入脉冲代码 EO100，然后按 OK 按钮。将比色皿转移到电穿孔器上，然后按触摸屏上的"开始"按钮启动电穿孔。电穿孔后，立即向比色皿中加入培养基反应体积的五倍。

现在轻轻地将细胞转移到准备好的板上，然后将板放回组织培养箱中。如前所述进行培养基更换后，收集10微升细胞并使用Turk溶液用血细胞计数器以1:2的稀释度计数。将所需剂量的细胞重新铺在纤连蛋白包被的平板中进行转导，并分别铺板未转导的阴性对照细胞。

然后将慢病毒载体添加到每个含有细胞的孔中，保持每个细胞20个转导单位的剂量，以达到约30%的转导效率。但是，根据实验要求根据经验确定慢病毒载体剂量。最后，将细胞放回组织培养箱中6小时。

如前所述执行介质更改。富含c-Kit的HSC的荧光激活细胞分选产生了约0.2%的CD150阳性，CD34阴性，cKit阳性，Sca1阳性和谱系阴性的细胞。HSPC培养四周后，发现CD201阳性，CD150阳性，c-Kit阳性，Sca1阳性和谱系阴性部分约为10%用表达GFP的慢病毒载体转导后，GFP阳性细胞约为30%当汇合时，培养物的预期密度约为每毫升200万个细胞。

在进行第一次培养基更换的前24至48小时内观察到大约50%的细胞死亡。然而，一周后，细胞数量恢复到接种细胞数的80%至100%。使用新鲜和预热培养基进行准确的培养基更换对于这种HSC培养方法的长期稳定性至关重要。

自2019年原始方法发表以来，该领域已开始以不同的方式使用它来研究HSC生物学。