为了评估有前景和新颖的基因治疗方法的效率和安全性，在经过验证的临床前细胞体内进行基因修饰细胞的综合测试至关重要。相关细胞表面标记物的保存，试剂的交叉反应，以及应用与非人类灵长类动物模型相同的支持性治疗，以密切模仿临床参数的能力。与我展示这个程序的将是阿奈·佩雷斯，他是汉斯-彼得·基姆博士实验室的研究技术员。
首先将从健康的非人类灵长类动物捐赠者中分离出来的10至12毫升等同骨髓加入50毫升锥形管中。用血液缓冲液将管的体积调至50毫升，并在室温下孵育细胞长达7分钟。通过离心去除细胞碎片，吸气除最后两到五毫升的上经剂。
通过轻拂管将颗粒重新悬浮在残留上流液量中，并使用 70 微米孔细胞过滤器将骨髓悬浮液转移到新的 50 毫升管中，以去除任何血块。加入新鲜的解血缓冲液，使体积达到50毫升，并在室温下再孵育细胞5分钟，然后通过离心收集。吸气所有上流液，并在10毫升的最大缓冲液中重新暂停细胞。
在通过另外一个70微米孔隙滤株过滤细胞悬浮液之前，用40毫升的新鲜缓冲液冲洗管子，然后用细胞悬浮液进行清洗。根据标准磁辅助细胞分选方案对CD34阳性细胞进行浓缩后，将珠子分离细胞洗涤至50毫升的新鲜最大缓冲液，并在HSPC介质中重新悬浮颗粒。然后将10至20毫升的细胞板入通风组织培养处理T75烧瓶，在37摄氏度和5%的二氧化碳培养箱中进行隔夜培养。
为了评估骨髓细胞样本的富原前和后扩充纯度，创建一个流动细胞学方案，其适当的图谱和种群层次结构显示所有事件散射的所有门、CD34 阳性、造血干细胞、多能性一个红细胞性骨髓祖体和淋巴骨髓祖体祖细胞。接下来，运行一个未染色的、预富集的白细胞样本，以调整前向和侧散射参数的电压，以及所有荧光通道，然后用单染色补偿珠来调节相邻通道之间的补偿。然后使用经过调整和补偿的协议运行所有剩余的未染色和染色样品，以记录 CD34 浓缩效率。
当所有补偿都设置后，配置细胞分拣机，用于将CD34子集的排序纯化到聚落形成细胞测定中，并加载染色的CD34富集样品管到细胞仪上。然后记录 2000 到 3000 事件，并微调排序门以适应信号强度和目标群体。当设置完成后，获取将流速调整为500至1000个细胞/秒的细胞，从散射、CD34阳性、造血干细胞、多能性抗红细胞性骨髓祖细胞和淋巴骨髓祖细胞门分拣800至1200个细胞，每个管含有3.6毫升的菌群形成细胞介质。
在排序漩涡收集管结束时，并添加一毫升细胞悬浮液到三个无菌3.5厘米，非组织培养处理的培养处理培养皿设置在个别15厘米的培养皿每个细胞群体为10-14天孵育在37摄氏度。第二天早上，使用10毫升移液器用无菌HSS从每个烧瓶底部轻轻冲洗粘附细胞，通过离心收集收获的细胞。每毫升浓度为1 x 10至第6个细胞，在转导介质中重新发送细胞。
并在一个井中加入一毫升细胞，用于模拟控制涂覆12井板的重组纤维素片段，在细胞培养箱中隔夜孵化。然后将剩余细胞的10毫升等同物加入重组纤维素片段中，涂上T75烧瓶，在细胞培养箱中孵化30分钟，并加入瓶盖。在孵育过程中解冻病毒条件介质样本，并计算要添加的病毒数量，根据滴度和每毫升细胞的传染性单位数量。
将烧瓶从培养箱中取出，在每个烧瓶中加入适当量的病毒调节介质，然后将细胞返回37摄氏度和5%的二氧化碳。第二天早上，将细胞从烧瓶转移到单独的50毫升锥形管中。每次洗涤时，将细胞洗涤至多达 50 毫升的 HBSS，并重复此步骤多达三次以清除残留病毒。
在HSPC介质中孵育细胞两小时，辅以前列腺素E2。然后清洗细胞，在10毫升的HSSS中重新补充细胞，每管补充2%的自体血清。然后使用装有 16.5 量针的 20 毫升注射器吸升细胞悬浮液。用新鲜的HSS加上2%的自体血清清洗管内，吸进注射器。
小心地用针盖盖住注射器，然后将细胞溶液放在冰上，直到其输注到自体宿主。为了确定转导细胞的基因修饰效率，将每毫升HSPC培养的板1 x 10到第6个保留模拟或转导细胞放到非组织培养处理板上。第二天、第五天和十二天转导后，收获并计算细胞数。
在第二天和第五天，以每毫升浓度1 x 10至第6次，在新鲜HSPC介质中重新镀33%的细胞。在第二天、第五天和第十二天，冻结33%的细胞在DNA提取缓冲液中进行定量实时PCR，然后根据标准方案通过流式细胞分析最终33%的细胞，以评估造血后代的表型成分。要通过流式细胞学量化转基因表达式，请添加三个额外的侧散射与
转基因图;并门在造血干细胞上的第一个情节，第二个情节的多能性骨髓祖细胞，第三个情节在淋巴骨髓祖细胞上，所有与转基因。然后记录 2000 到 3000 事件，并微调排序门以适应信号强度和目标群体。
使用此协议，富集的非人类灵长类动物 CD34 阳性 HSPC 的数量通常与输入的白细胞总数成正比。正如先前的发现已经证明，总CD34阳性HSPC产品包括细胞不是真正的长期和移植造血干细胞，这些流细胞学为基础的和菌落形成细胞技术可用于可靠地识别和区分从承诺的祖先长期造血干细胞丰富的子集。CD34阳性的人类干细胞富集细胞可以有效地利用白细胞载体进行基因修饰。
携带非整合载体拷贝的细胞在12天的液体培养测定期内稀释出来，而基因组中稳定整合的载体被传递给所有后代。如菌落形成细胞测定中向量的表达所证实的。这种临床前方法可用于分离基因改造在质量控制的非人类灵长类体造血干细胞和祖细胞的基因治疗。
这种方法可以很容易地适应其他物种，造血干细胞和祖细胞的来源，基因治疗工具和疾病。这种经过彻底审查的协议为许多人类疾病的疗效疗法建模显示出了巨大的希望。请记住，使用非人类灵长类动物组织需要加强安全措施，包括个人防护设备。
