通过微注射研究3D组织衍生的人体器官培养系统中的隐孢子虫感染

使用这种孢子体纯化和微注射程序，基本上任何宿主微生物都可以在任何组织衍生器官系统中进行研究。使用这种技术，我们可以控制注入器官流明或器官的一面的纯孢子体的数量。要纯化C.parvum孢子体，将卵母细胞转移到15毫升管中，然后以每毫升外站介质浓度的1倍10再给第七个卵母细胞。

在37摄氏度下60至90分钟后，将14毫升适当的洗涤溶液与卵母细胞混合，通过离心沉淀细胞。小心吸制上流液，避免失去卵母细胞，并在每一到两毫升DMEM浓度的三倍10至第七粒中重新暂停孢子球。要去除剩余的卵母体和壳体，请将装有 47 毫升滤芯支架装置的 10 毫升注射器筒放入 4 摄氏度的 15 毫升管中。

向过滤器组件中加入 7.5 毫升的孢子石悬浮液。当整个体积通过过滤器的重力，洗净任何剩余的细胞通过过滤器与另外7.5毫升的DMEM。当所有洗涤液都经过过滤器时，通过离心收集过滤的孢子石悬浮液10分钟，并在50至100微升适当的有机体培养基中标记颗粒，辅以0.05%的快速绿色染料，以及L-谷胱甘肽、贝塔因、L-半胱氨酸、亚油酸和含有还原缓冲的牛磺酸。

要将寄生虫微注射到 3D 器官的一侧，首先使用微移子拉拔器准备玻璃注射毛细管。使用钳子将毛细管的尖端切割到 9 到 12 微米直径，以便于流水杨石或卵石，如果您选择直接注射卵母质，并使用微装载机尖端填充每个毛细管，并填充标有卵石或孢子石悬浮液的快速绿色染料。然后，将第一个充满孢子的毛细管装入显微显胶中，并使用倒置显微镜以 5 倍的放大倍率和恒定的压力将悬浮液的 100 到 200 纳米光插入每个器官中。

外站协议导致从大约 70% 到 80% 的卵石释放孢子虫。因此，通过三微米过滤过滤掉剩余的卵壳至关重要。去除近100%的未切除的卵母细胞。

此外，添加绿色染料有助于确保注射所有器官，并允许在注射后至少24小时内对注射的器官进行可视化。虽然这是一种行之有效的方法，但扫描电子显微镜可用于确保外显器过程不会损坏孢子虫或卵石。向器官流明注射等量的卵母线可以通过简单的显微成像得到视觉确认。

免疫荧光分析也可用于探索受隐孢子虫感染的细胞类型。分化的有机体被感染五天后，通过将部分卵母细胞干燥到粘合剂幻灯片上，用甲醇固定卵母细胞，将DAPI染色与合适的卵母细胞特异性抗体相结合，可以确认卵母细胞内存在孢子体的存在。为了获得最佳效果，请使用新鲜的卵巢，使用相同的毛细管进行所有注射，并在注射后每天更换介质。

使用这种技术，各种实验室现在开始使用器官来研究宿主-微生物的相互作用。我们正在研究类似的有机体微培养环境中的共体和其他病原体。由于隐孢子虫是一种人类寄生虫，因此按照2级安全规定进行这些实验非常重要。