在Vivo功能研究的疾病相关的稀有人类变异使用果蝇

该协议使我们能够确定与疾病有关的人类基因中的错变是否影响蛋白质功能。即使使用最先进的算法，也很难在计算上完成这一任务。该技术允许使用体内系统果蝇黑色素酯快速分析人类蛋白质中的错香变异，这种变异比脊椎动物模型生物体更快、更经济高效。

证明特定变异影响蛋白质功能直接影响罕见疾病的诊断，并作为疾病机制分析和潜在疗法的起点。在研究与罕见疾病有关的变种时，此协议特别有用，但它可以应用于自闭症和癌症等更常见的疾病。识别苍蝇中反映蛋白质功能的可重复表型可能具有挑战性。

表型可能因基因而异，而且可能很微妙。使用果蝇的人类蛋白质变异的功能研究可以基于救援实验或过度表达研究进行。在开始手术之前，收集有关感兴趣的人类基因及其模型生物体矫形体的信息。

通过过度表达飞行视觉系统中的参考和变异人类蛋白质来测试变异功能，在 Gal4 上游激活序列或 UAS 系统的控制下生成表达参考或变异人类 cDNA 的转基因苍蝇。要选择特定的 Gal4 线来表示特定飞行组织中的人类蛋白质，请从 Gal4 线穿过三到五个处女，每个 UAS 人类 cDNA 转基因线中的男性有 3 到 5 个，在单个小瓶中或重复。每两到三天转移一次十字架，以从单个十字架上获取尽可能多的动物，并在解剖显微镜下检查被封闭的动物，以确定参考菌株和变异菌株之间的任何差异。

如果有可见的缺陷，图像苍蝇记录表型。为了产生苍蝇来测试视觉系统的功能缺陷，交叉处女从罗多普辛1 Gal4线到男性参考或变种UAS人类cDNA转基因，以表达人类蛋白质感兴趣的光受体R1到R6在苍蝇视网膜。一旦苍蝇开始封闭，将后代收集到新鲜的小瓶中，将小瓶返回到一个孵化器，以适当的实验温度再增加三天，使视觉系统成熟。

在孵化结束时，用适当的麻醉方法固定苍蝇，并轻轻地将每只苍蝇的一侧粘在玻璃显微镜幻灯片上。设置电雷电图仪后，将 1.2 毫米玻璃毛细管放入针头拉拔器中，并打破毛细管，获得两个直径小于 0.5 毫米的锋利空心锥形电极。小心用 100 毫摩尔盐水溶液填充毛细管，避免气泡，将玻璃毛细管滑过银线电极。

将毛细管夹到位，使苍蝇在室温下完全黑暗至少10分钟。习惯结束时，将装有苍蝇的幻灯片放在记录装置上，然后移动携带参考和记录电极的微操纵器靠近感兴趣的苍蝇。观察电极的尖端，小心地将参考电极放入穿透角质层的苍蝇的胸骨中，然后将记录电极放在眼睛表面。

对于成功的电雷电图记录，注意对记录电极施加适当压力，以便在不穿透眼睛的情况下产生小酒窝。放置电极后，关闭主灯三分钟，使苍蝇适应黑暗环境。在重新适应期结束时，使用相同电极，以 20 秒的速度每秒钟打开和关闭快门，记录每根基因型每张幻灯片至少 15 飞的电重电图。

当参考和变种苍蝇的录音完成时，比较参考、变体和控件中的电重电图记录，以评估差异。然后评估电雷丁图数据，以发现瞬变、去极化、关闭瞬变和极化的变化。在这个具有代表性的实验中，对TBX2进行了基于过度表达的研究，因为人类参考TBX2无法在功能上取代正交飞行基因，使得基于救援的策略无法实现。

当参考人类TBX2在发育中的眼睛和大脑部分使用无眼Gal4过度表达时，过度表达会导致大约85%的致命性和眼睛大小的显著减少。相比之下，变异转基因在造成致命性方面不太有效，在相同的实验条件下，使用同一个驱动器诱导小眼表型，这表明该变异影响蛋白质功能。此外，当参考人类 TBX2 在使用 rhodopsin Gal4 的光感受器中过度表达时，过度表达会导致电雷素图跟踪的显著变化。

当变异蛋白表达时，这种表型是温和的，进一步证明兴趣的变异影响体内的蛋白质功能。需要注意的是，每个基因都是独一无二的，因此没有一项实验可以评估所有疾病相关变异的影响。除了使用人类cDNA之外，还可以通过将类似的变异引入矫形飞行基因的进化保存残留物，来确定该变种是否具有功能性后果。

使用这种方法，我们与未确诊的疾病网络和其他组合作，为多项人类疾病基因发现研究做出了贡献。