Этот протокол позволяет нам определить, влияют ли варианты миссенса в генах человека, связанных с болезнями, на белковую функцию. Это трудно сделать вычислительно даже с помощью самых сложных алгоритмов. Этот метод позволяет быстро анализ вариантов missense в человеческих белков с помощью системы in vivo Drosophila меланогастер, который быстрее и рентабельнее, чем позвоночных модель организмов.
Демонстрация того, что конкретный вариант влияет на белковую функцию, непосредственно способствует диагностике редких заболеваний и служит отправной точкой для анализа механизмов заболевания и потенциальной терапии. Этот протокол особенно полезен при изучении вариантов, связанных с редкими заболеваниями, но он может быть применен к более распространенным заболеваниям, таким как аутизм и рак. Выявление воспроизводимых фенотипов у мух, отражающих белковую функцию, может быть сложной задачей.
Фенотипы могут варьироваться от гена к гену и могут быть тонкими. Функциональные исследования вариантов в человеческих белках с использованием дрозофилы могут быть выполнены на основе спасательных экспериментов или исследований переэкспрессии. Перед началом процедуры соберите информацию о интересном человеческом гене и его модельных ортопедических организмах.
Чтобы проверить функцию варианта путем переэкспрессирования ссылки и вариант человеческих белков в лету зрительной системы, генерировать трансгенных мух, которые выражают ссылку или вариант человека cDNAs представляющих интерес под контролем Gal4 вверх по течению активации последовательности или UAS системы. Чтобы выбрать конкретную линию Gal4, чтобы выразить человеческие белки в конкретной ткани мухи, пересекайте от трех до пяти девственных самок из линии Gal4 с тремя-пятью самцами от каждого из трансгенных линий UAS человека в одиночных флаконах или в дубликатах. Передача крестов каждые два-три дня, чтобы получить как можно больше животных, выкрывающих из одного креста, как это возможно, и изучить исключенное животное под микроскопом вскрытия, чтобы определить любые различия между ссылкой и вариант штаммов.
Если есть видимый дефект, изображение мух для документирования фенотипов. Для генерации мух для проверки функциональных дефектов в зрительной системе, крест девственных самок от родопсин 1 Gal4 линии для мужчин со ссылкой или вариант UAS человека cDNA трансгенов, чтобы выразить человеческие белки интерес в фоторецепторы R1 к R6 в сетчатке мухи. Как только мухи начинают вырезать, собрать потомство в свежие флаконы и вернуть флаконы в инкубатор установлен на соответствующую экспериментальную температуру в течение дополнительных трех дней, чтобы зрительная система созреть.
В конце инкубации обездвижьте мух соответствующим методом анестезии и аккуратно приклейте одну сторону каждой мухи на стеклянную микроскопьную горку. После установки электроретинограммы поместите стеклянный капилляр диаметром 1,2 миллиметра в иглу и разбейте капиллярную трубку, чтобы получить два острых полых конические электрода диаметром менее 0,5 миллиметра. Заполните капилляры 100 миллимолярным солевым раствором, чтобы избежать пузырьков воздуха и сдвиньте стеклянные капилляры над электродами серебряной проволоки.
Зажим капилляров на месте и акклиматизировать мух до полной темноты, по крайней мере 10 минут при комнатной температуре. В конце привыкания поместите слайд, содержащий мух, на записывающий аппарат и переместит микроманипуляторы, несущие эталонные и записывающие электроды, близко к лету интереса. Наблюдая за кончиком электрода, аккуратно поместите эталонный электрод в грудную клетку мухи, проникающей в кутикулу, и поместите записывающий электрод на поверхность глаза.
Для успешной записи электроретинограммы, позаботьтесь, чтобы применить соответствующее количество давления к записи электрода, так что это вызывает небольшой ямочка без проникновения в глаз. Когда электроды были размещены, выключите первичный свет в течение трех минут, чтобы вновь акклиматизировать мух в темную среду. В конце периода повторной акклиматизации откройте и закройте затвор один раз в секунду в течение 20 секунд, записывая электроретинограммы не менее 15 мух на слайд на один генотип в состоянии с использованием тех же электродов.
Когда записи из ссылки и вариант мух завершены, сравнить электроретинограммы записи из ссылки, вариант и элементы управления для оценки различий. Затем оцените данные электроретинограммы для изменений на переходных, деполяризации, от переходных и реполяризации. В этом репрезентативном эксперименте были проведены исследования на основе переэкспрессии для TBX2, так как человеческая ссылка TBX2 не смогла функционально заменить ортологичный ген мухи, что делает стратегии на основе спасательных работ невозможными.
Когда ссылка человека TBX2 был переэкспрессирован в развивающихся глаз и частей мозга с помощью безглазых Gal4, переэкспрессия приводит к примерно 85% летальности и значительное сокращение размера глаз. В отличие от этого, вариант трансгена является менее мощным в причинении летальности и вызывает небольшой фенотип глаз с использованием того же драйвера в идентичных экспериментальных условиях, предполагая, что вариант влияет на функцию белка. Кроме того, когда эталонный человеческий TBX2 переэкспрессирован в фоторецепторах с использованием родопсин Gal4, переэкспрессия вызывает значительное изменение в электроретинограмме следа.
Этот фенотип мягче, когда вариант белка выражается предоставление дополнительных доказательств того, что вариант интереса влияет на функцию белка in vivo. Важно отметить, что каждый ген уникален, поэтому нет единого эксперимента, который может оценить влияние всех связанных с болезнью вариантов. В дополнение к работе с человеческими cDNAs, можно также определить, если вариант имеет функциональные последствия путем введения аналогичных вариантов в эволюционно сохраненных остатков ортологического гена мухи.
Используя этот метод, мы внесли свой вклад в ряд исследований по открытию генов болезней человека в сотрудничестве с Сетью недиагностированных болезней и другими группами.
