Este protocolo nos permite determinar se variantes missense em genes humanos que estão ligadas a doenças afetam a função proteica. Isso é difícil de conseguir computacionalmente mesmo com algoritmos de última geração. Esta técnica permite uma análise rápida das variantes missense em proteínas humanas usando um sistema in vivo Drosophila melanogaster que é mais rápido e mais econômico do que organismos modelo vertebrados.
Demonstrar que uma variante específica afeta a função proteica contribui diretamente para o diagnóstico de doenças raras e serve como ponto de partida para a análise do mecanismo da doença e terapias potenciais. Este protocolo é particularmente útil ao estudar variantes ligadas a doenças raras, mas pode ser aplicado a doenças mais comuns como autismo e câncer. Identificar fenótipos reprodutíveis em moscas que refletem a função proteica pode ser um desafio.
Os fenótipos podem variar de gene para gene e podem ser sutis. Estudos funcionais de variantes em proteínas humanas usando Drosophila podem ser realizados com base em experimentos de resgate ou estudos de superexpressão. Antes de iniciar o procedimento, reúna informações sobre o gene humano de interesse e seus ortologs organismo modelo.
Para testar a função variante, superexpressando referências e variantes de proteínas humanas no sistema visual de mosca, gerar moscas transgênicas que expressam referência ou variante de cDNAs humanas de interesse sob o controle da sequência de ativação gal4 upstream ou sistema UAS. Para selecionar uma linha Gal4 específica para expressar as proteínas humanas em um tecido de mosca específico, cruze de três a cinco fêmeas virgens da linha Gal4 com três a cinco machos de cada uma das linhas transgênicas cDNA humanas da UAS em frascos únicos ou em duplicatas. Transfira as cruzes a cada dois ou três dias para obter o maior número possível de animais que se aproximam de uma única cruz e examinar o animal eclosado sob um microscópio de dissecção para identificar quaisquer diferenças entre as cepas de referência e variantes.
Se houver um defeito visível, imagem as moscas para documentar os fenótipos. Para gerar moscas para testar defeitos funcionais no sistema visual, cruzam fêmeas virgens da linha rhodopsin 1 Gal4 para machos com referência ou variante UAS transgenes humanos para expressar as proteínas humanas de interesse nos fotoreceptores R1 a R6 na retina mosca. Uma vez que as moscas começam a eclose, reúna a prole em frascos frescos e devolva os frascos a uma incubadora definida à temperatura experimental apropriada por mais três dias para permitir que o sistema visual amadureca.
No final da incubação, imobilize as moscas com um método de anestesia apropriado e cole suavemente um lado de cada mosca em um slide de microscópio de vidro. Depois de montar uma plataforma de eletroretinograma, coloque um capilar de vidro de 1,2 milímetros em um puxador de agulha e quebre o tubo capilar para obter dois eletrodos afilados ocos afiados com menos de 0,5 milímetros de diâmetro. Encha os capilares com solução salina de 100 mililitros, tomando cuidado para evitar bolhas de ar e deslize os capilares de vidro sobre os eletrodos de fio de prata.
Fixar os capilares no lugar e aclimatar as moscas para completar a escuridão por pelo menos 10 minutos em temperatura ambiente. No final da habituação, coloque o slide contendo as moscas sobre o aparelho de gravação e mova os micromanipuladores carregando a referência e registrando eletrodos próximos à mosca de interesse. Observando a ponta do eletrodo, coloque cuidadosamente o eletrodo de referência no tórax da mosca penetrando na cutícula e coloque o eletrodo de gravação na superfície do olho.
Para gravações de eletroretinograma bem sucedidas, tome cuidado para aplicar uma quantidade adequada de pressão ao eletrodo de gravação para que ele cause uma pequena covinha sem penetrar no olho. Quando os eletrodos tiverem sido colocados, desligue a luz primária por três minutos para reaclimatar as moscas ao ambiente escuro. No final do período de re-aclimatação, abra e feche o obturador uma vez por segundo durante 20 segundos registrando os eletroretinogramas de pelo menos 15 moscas por deslizamento por genótipo por condição usando os mesmos eletrodos.
Quando as gravações da referência e da variante voarem completas, compare as gravações de eletroretinograma da referência, variante e controles para avaliar as diferenças. Em seguida, avalie os dados do eletroretinograma para alterações nos transitórios, despolarização, off transitórios e repolarização. Neste experimento representativo, foram realizados estudos baseados em superexpressão para TBX2, uma vez que a referência humana TBX2 não foi capaz de substituir funcionalmente o gene ortologos da mosca, tornando impossível estratégias baseadas em resgate.
Quando a referência tbx2 humana foi superexpressa no olho em desenvolvimento e partes do cérebro usando Gal4 sem olhos, a superexpressão resulta em uma mortalidade de aproximadamente 85% e uma redução significativa no tamanho dos olhos. Em contraste, a variante transgene é menos potente em causar letalidade e induz um pequeno fenótipo ocular usando o mesmo motorista em condições experimentais idênticas sugerindo que a variante afeta a função proteica. Além disso, quando um TBX2 humano de referência é superexpresso nos fotorreceptores usando rhodopsin Gal4, a superexpressão causa uma alteração significativa no traço do eletroretinograma.
Este fenótipo é mais suave quando a proteína variante é expressa fornecendo mais evidências de que a variante de interesse afeta a função proteica in vivo. É importante notar que cada gene é único para que não haja um único experimento que possa avaliar o impacto de todas as variantes associadas à doença. Além de trabalhar com cDNAs humanos, pode-se determinar se a variante tem consequências funcionais introduzindo variantes análogas em resíduos evolutivamente conservados do gene da mosca ortologos.
Usando esse método, contribuímos para uma série de estudos de descoberta de genes de doenças humanas em colaboração com a Rede de Doenças Não Diagnosticadas e outros grupos.
