研究脑癌和神经退行性疾病的人类神经器官

在再生医学中，一个针对特定神经细胞类型的多能干细胞分化的稳健协议是一个有价值的工具。在我们的案例中，这个协议对于研究胶质母细胞瘤发育和帕金森病是非常有用的。因此，首先，三维器官的生成具有密切模仿生理发育的优点，而且多能干细胞产生大小校准神经球具有很高的可重复性。

以下程序将由来自我们实验室的博士生马农·洛卡泰利演示。在开始三D培养前24小时，用无血清介质代替HESC培养基，辅以10微摩尔 ROCK抑制剂。细胞应为60%的汇合。

第二天，通过去除介质和用不含钙和无镁的PBS冲洗，分离hESC菌落作为单细胞。然后，加入5毫升的酶溶解溶液，在37摄氏度下孵育一至两分钟。之后，用10微摩尔 ROCK抑制剂收集无血清介质中的细胞，并在300倍g下将细胞离心5分钟。

离心后，检查细胞颗粒的大小。去除上清液，在10毫升无血清介质中计数细胞，并辅以10微摩尔 ROCK抑制剂。同时，每口井用两毫升无血清介质冲洗微井板，并在1，200次g下离心5分钟，以清除所有气泡，以防止神经球的形成。

接下来，在12.5毫升无血清介质中准备2820万个细胞，并辅以10微摩尔 ROCK抑制剂。每微井分配1000个细胞。将300倍g的细胞离心5分钟，并在显微镜下检查微井板中细胞的均质重新分离。

将板在37摄氏度的培养箱中过夜。第二天，检查微井板，检查每个微井中形成球体的大小。使用辅二SMAD抑制鸡尾酒的介质将球体转移到六井板，促进快速神经感应。

从这一步前进，球体以60转/分的转速旋转，以防止它们粘在一起或粘在板上。第一天到第四天，在进行神经感应之前，每两到三天更换一次介质。从第四天到第11天，通过添加EGF和bFGF以每毫升10毫微克添加到B27介质辅以双SMAD鸡尾酒，促进HESC衍生神经玫瑰花环的增殖。

从第11天到第13天，培养B27介质中的球体，辅以0.5微摩尔BMP抑制剂。从第13天到第21天，培养B27介质中的球体，以每毫升10毫微克和1微摩尔伽马-分泌酶抑制剂为补充GDNF和BDNF。在第21天，将一个培养板插入到新的六井板的一个井中。

之后，在膜插入物下的每孔中加入一毫升B27介质，并辅以生长因子和抑制剂。随后，将球体板放在沉积在培养板上的亲水PTFE膜上，并在随后三周的分化中每两到三天更换一次介质。停止此步骤的旋转。

玫瑰花环的存在表明神经分化的开始。从第21天到25日，在同一神经成熟媒介中培养人类神经器官。然后，从第25天到28日，只补充B27介质与一个微摩尔伽马-分泌酶抑制剂。

从第28天到第39天，停止添加伽马-秘密酶抑制剂，继续在B27介质中继续人类神经器官培养。三周后，神经器官准备用于GIC植入。在第 0 天，在双 D 培养中放大 60% 的合合。

然后，用含有双SMAD抑制鸡尾酒的无血清培养基取代用于维持HESCs多能特性的干细胞介质，开始神经诱导和10微摩尔 ROCK抑制剂，以提高第二天通过过程中细胞的存活率。第一天，准备微井板，每井含有2.5毫升的无血清介质，含有相同浓度的 ROCK 抑制剂和双SMAD抑制分子。为了区分细胞对神经管腹型，添加SHH和FGF8在100南克每毫升和两个微摩尔平滑激动。

加入介质后，将板以 1，200 倍 g 离心 5 分钟，以清除微井中的气泡。一旦微井板准备好使用半分型介质，取出hESC的介质，并迅速用不含钙和氯化镁的PBS清洗。在T75烧瓶中加入7.5毫升重组酶溶液，将菌落分离成单细胞悬浮液。

在37摄氏度下孵育细胞2分钟，然后加入7.5毫升DMEM F12。随后，收集电池悬浮液和离心机在300倍g5分钟。然后，取出上清液，并计算用于准备微井板的相同介质中的细胞。

调整介质体积，通过制备2.5毫升介质中的470万个细胞，并添加到先前已经放入的2.5毫升的培养中，获得细胞悬浮液，从而形成每个微井包含1000个细胞的神经球。为了正确分配每个微井中的细胞，轻轻摇动板，以300倍g离心5分钟。接下来，在37摄氏度下孵育板24小时，生成球体。

在第二天，用介质轻轻冲洗微井，并在组织处理的六井板中转移球体。将球体旋转至37摄氏度，每两到三天更换一半介质，使用新鲜介质。第三天至第13天，为了增强神经感应，用中脑识别物转化为神经祖细胞，用三微摩尔葛兰素史克-3-β抑制剂补充该介质。

将样品分成两个新的组织处理六孔板，以减少球体密度，避免球体聚集。第8天，开始神经成熟，切换到新的媒介与生长因子，并改变介质每两到三天。在第21天，将一个培养板插入到新的六孔板的一个孔中，并在膜插入下加入1.2毫升用于神经球分化的神经成熟介质。

然后，将 PTFE 膜放在培养板插入件上。最后，在PTFE膜的空液界面条件下，产生神经器官，在100个神经球中播种。停止此步骤的旋转，每两到三天更换一次介质，直到达到所需的区分时间点。

这里是用于生成多巴胺神经器官的标准化协议的示意图。这些图像中显示的多巴胺神经器官的免疫荧光分析表明TH免疫反应细胞共同表达Nurr1，一种中脑特异性标记。这两个图形表示由定量RT-PCR评估的TH和Nur1基因表达的动力学。

下面是使用 MEA 平台记录的原始数据的示例。每个尖峰都用垂直线显示，而其余轨迹是噪声。这张照片代表一个沉积在 MEA 上的神经球。

这些图表显示了从原始数据检测到的典型峰值的叠加。黑色粗体曲线表示相应红色曲线的平均值。此栅格图显示与检测到的每个峰值关联的时间戳。

不同的颜色突出显示不同的电极。该协议允许研究人员回答有关癌细胞与神经器官相互作用的问题，以及直接筛选与多巴胺机器官。