用于研究基质细胞代谢串扰的人类3D细胞外基质-脂肪培养模型

我们的协议表明，在没有经典致病介质的情况下，ECM 可促进致病性分化，并且是首次证明 ECM 对细胞代谢的疾病特异性调控。我们的技术提供了一个工具，用于解剖 ECM 和脂肪细胞在脂肪组织代谢中的作用，并允许研究 ECM 在调节脂肪组织平衡中的作用。与标准 2D 细胞培养相比，我们的 3D 模型允许在 2 型糖尿病背景下对脂肪细胞和脂肪组织 ECM 之间的相声进行更有力的检查和解剖。

我们建议从较小的样本开始，以测量其细胞化水平。请记住，细胞的生长以及组织去细胞化程度的变异性。重要的是要观察组织之前和之后的每一步，以确保组织变得去细胞化，并了解样品之间的潜在差异。

从手术获得内脏脂肪组织或增值税后，在50毫升锥形管中加入5-10克组织至15-25毫升冷冻缓冲液，准备储存。将样品完全浸入零下80摄氏度，直到去细胞化。对于预细胞分离，将两克新鲜样品的完好增值税放入20毫升胶原酶II型溶液中，然后将无菌剪刀插入管子中，彻底切碎组织。

一旦被切碎到细浆中，在37摄氏度的轨道摇床上，在胶原酶溶液中孵育60分钟。孵育后，通过100微米尼龙网过滤消化结果，放入一个新鲜的50毫升锥形管中。消化的应为具有适量粘度和少量未消化组织的残留链的黄橙色液体。

将样品以270倍g离心10分钟，取出上流液，用移液器将细胞颗粒重新用在两毫升1X RBC解液中。在25摄氏度下孵育溶液1分钟，然后加入10毫升15%FBS DMEM F12，以270倍g离心10分钟。要准备 ECM，请通过定期轻轻手动搅拌将先前冻结的 VAT 样品在预热水浴中孵育 20 分钟，将以前冻结的 VAT 样品冻结/解冻至 37 摄氏度。

解冻后，将组织转回零下80摄氏度20分钟，并重复冷冻/解冻过程三次，以解冻结束。使用无菌钳将 VAT 样品转移到含有 15-25 毫升酶溶液 1 的新鲜 50 毫升圆锥形管中，确保样品完全浸入。然后在37摄氏度下孵育过夜，同时在130 RPM下摇晃。

第二天，用15-25毫升的冲洗缓冲液洗样品三次，每次洗涤后倒出溶液。将样品转移到一个新鲜的50毫升管与15-25毫升的酶溶液2，并孵育过夜。使用冲洗缓冲液重复洗涤，将样品转移到含有 15-25 毫升极性溶剂萃取溶液的新鲜管中。

在摇动时孵育样品过夜。使用极性溶剂溶液孵育后，检查样品是否去除脂质非常重要。如果未去除大部分脂质，则可能需要重复此步骤。

可以使用较短的孵育时间。孵育后，将样品转移到含有15-25毫升冲洗缓冲液的新鲜管子中，并在摇床上清洗样品三次。然后用70%乙醇溶液洗样品三次，每次洗涤后倒掉乙醇。

用储存溶液清洗样品一次，然后使用无菌钳子转移到含有 15-25 毫升存储溶液的新鲜管子中，确保将其完全浸浸。然后，样品可以在四摄氏度下储存长达一个月。异丙醇和乙醇是易燃的，必须在室温下处理，并处理在易燃废物中。

任何人类废物都必须与通常的生物危害废物分开处理。将存储的 ECM 碎片转移到 24 孔板的单个孔中，无菌钳子可添加计划下游测定所需的尽可能多的碎片。在轨道摇床上用500微升70%乙醇洗涤三次，然后用PBS洗涤三次，以补充水分。

使用无菌剪刀将 ECM 切割成 100 毫克碎片。将每个碎片放入24井板的一个井中，并在25摄氏度下孵育板15分钟，让多余的PBS从碎片中挤出。然后用移液器小心地从井中去除剩余的 PBS。

通过将细胞直接移入 ECM，用 20 微升的预细胞悬浮液为每个片段播种。将移液器尖端放入 ECM 中，轻轻将移液器尖端排出到矩阵中心，确保电池悬架不会溢出，最终位于井底。如果单元悬架从 ECM 溢出，则从该位置拆下移液器尖端，并将其插入 ECM 的其他位置。

细胞播种后，在37摄氏度下孵育 ECM 40 分钟。用 500 微升生长介质填充每一个井，以覆盖种子 ECM 碎片。在37摄氏度和5%的二氧化碳下培养细胞72小时。

72 小时后，小心吸气生长介质，而不干扰 ECM 碎片。添加 500 微升的分化介质和培养细胞 14 天，每两到三天更换一次培养。使用光显微镜检查差异。

细胞会积累脂质，变成棕色-黄色的颜色，并变得更加球形，因为他们区分。脂肪组织ECM的制备，与预细胞的播种，并在体外分化为成熟的脂肪细胞监测与扫描电子显微镜，揭示了ECM的去细胞化和随后的脂质含有脂肪在重新播种和分化后重新捕获。脱细胞 ECM 的胶原蛋白 1 特异性免疫组织化学显示维持胶原蛋白微结构，而活体和固定 3D ECM-adipocy 细胞构造的油红-O 染色显示脂质含有脂肪细胞。

使用定量实时PCR对 ECM 中分化的脂肪细胞进行筛选，结果表明，这些基因相对于在 ECM 培养的未分化前细胞，在分化细胞中得到调节。显示了成绩单水平的全部差异。来自糖尿病和非糖尿病受试者的ECM和脂肪细胞的四种组合受到代谢表型的诊断。

在糖尿病组织的构造中发现脂解功能的葡萄糖吸收受损。重要的是，发现非糖尿病ECM可挽救糖尿病脂肪细胞中胰岛素刺激的葡萄糖吸收和脂解能力。分离的预核细胞、去细胞化组织和重新播种的 ECM 的污染并不少见。

在整个协议中必须努力维护无菌。