用螺旋粘度计对人血小板和细胞表面受体进行均匀剪切检测

该协议使我们能够回答有关剪切作用于溶液中细胞的多种问题，并显著控制剪切持续时间和幅度。与其他技术不同，这种技术可以检测剪切对固定细胞的影响，它允许我们将剪切应用于溶液中的细胞，并适合一系列下游信号检测方法。在从同意的、健康的成人供体获得外周血液后，在4.5毫升的管中，用3.8%的三钠柠檬酸盐，将血液离心以获得富含血小板的血浆，并使用移液器尖端切入45度角，小心去除由此产生的顶部、多云、黄色血小板丰富的血浆层。

通过完整的血液计数获得血小板计数，将血小板计数调整为每微升第五个血小板的2.5倍至第五个血小板，并汇集人类血小板贫乏血浆。然后，将悬浮液在 22 摄氏度下轻轻旋转。对于配体治疗，缓慢地将感兴趣的抗体或配体添加到富含血小板的血浆中，然后轻轻地混合血小板。

在孵育过程中，打开圆锥板粘度计，将板温设置为 22 摄氏度。5 到 10 分钟后，将经过处理的富含血小板的等离子体直接转移到板中心温度控制的锥板粘度计上，注意所有样品都沉积在接触点锥体和圆锥体之间。要对样品应用剪切，请根据粘度计手册计算剪切，然后以适当的速率和持续时间对样品应用剪切。

在应用结束时，将圆锥体从板上抬起约两毫米，使样品与板和圆锥体保持接触，并使用凝胶加载移液器尖端从样品体积中心收集 5 到 10 微升。然后在室温下用抗体对表面标记物孵育20分钟，并在室温下将样品在2%半甲醛中固定20分钟。要通过流式细胞学分析样本，请根据每个荧光因子的强度测量至少 20，000 个事件，并量化每个荧光标记的信号强度。

然后使用牛血清白蛋白或车辆的负面对照绘制闸门，排除负背景荧光事件，并量化所有实验条件下门内事件的百分比。用于响应剪切力应用的血小板激活标记表达式在时间依赖性方面不受管制。在这里，在两个针对糖蛋白1b-IX的N-终端域的抗体和一个在剪切和静态条件下对照抗体的两种抗体存在的情况下，具有代表性的人类血小板活化读数。

与静态条件或控制抗体存在相比，所有三种激活标记在剪切力和靶向抗体的存在中显著增加。值得注意的是，使用未结合力过低以触发糖蛋白 1b-IX 活化的抗体治疗不会触发在静态或剪切力条件下的血小板激活标记调节。此外，来自免疫血小板减少症患者的血浆含有对糖蛋白1b-IX的抗体触发剪切依赖反应，与来自没有糖蛋白1b-IX靶向抗体的患者的血浆相反。

除了流细胞计量分析外，接触过剪切力的细胞也可以被lys化为西印、ELISA和质谱分析，以确定蛋白质水平的任何变化。与一如既往，在使用血液或人体样本时，请务必穿戴适当的防护设备，并遵循您机构的实验室安全和血液出生病原体指南。