Ce protocole nous permet de répondre à une variété de questions sur la façon dont le cisaillement agit sur les cellules en solution et fournit un contrôle significatif sur la durée et l’ampleur du cisaillement. Contrairement à d’autres techniques, qui détectent l’effet du cisaillement sur les cellules immobilisées, cette technique nous permet d’appliquer le cisaillement aux cellules en solution et se prête à un spectre de méthodes de détection de signaux en aval. Après avoir obtenu le sang périphérique d’un donneur adulte consentant et en bonne santé dans un tube de 4,5 millilitres de citrate trisodique de 3,8 %, centrifugeuse du sang pour obtenir du plasma riche en plaquettes, et utiliser une pointe de pipette coupée à un angle de 45 degrés pour enlever soigneusement la couche plasmatique riche en plaquettes jaunes, nuageuse et en forme de plaquette jaune qui en résulte.
Obtenez le nombre de plaquettes par dénombrement complet du sang et ajustez le nombre de plaquettes à environ 2,5 fois 10 à la cinquième plaquette par microlitre avec du plasma pauvre en plaquettes humaines en commun. Ensuite, placez la suspension à 22 degrés Celsius avec une rotation douce. Pour le traitement ligand, ajouter lentement l’anticorps ou ligand d’intérêt au plasma riche en plaquettes, et mélanger les plaquettes doucement.
Pendant l’incubation, allumez le viscomètre de la plaque cène et réglez la température de la plaque à 22 degrés Celsius. Après cinq à dix minutes, transférer le plasma traité riche en plaquettes sur le viscomètre à plaque cène à température contrôlée directement au centre de la plaque, en prenant soin que tout l’échantillon soit déposé entre le cône et la plaque au point de contact. Pour appliquer le cisaillement sur l’échantillon, calculez le cisaillement selon le manuel du viscomètre et appliquez le cisaillement sur l’échantillon à la vitesse et à la durée appropriées.
À la fin de l’application, soulevez le cône à environ deux millimètres de la plaque, de sorte que l’échantillon reste en contact avec la plaque et le cône, et utilisez une pointe de pipette de chargement de gel pour recueillir de cinq à dix microlitres à partir du centre du volume de l’échantillon. Ensuite, incuber l’échantillon cisaillement avec des anticorps contre les marqueurs de surface d’intérêt pendant 20 minutes à température ambiante, et fixer les échantillons en paraformaldéhyde de 2% pendant 20 minutes à température ambiante. Pour analyser les échantillons par cytométrie de débit, recueillir au moins 20 000 événements pour chaque condition, et quantifier la force du signal de chaque marqueur fluorescent, en utilisant la valeur de hauteur pour l’intensité de chaque fluorophore.
Ensuite, utilisez un contrôle négatif avec de l’albumine de sérum bovin ou un véhicule pour dessiner une porte, à l’exclusion des événements fluorescents de fond négatifs, et quantifier le pourcentage d’événements à l’intérieur de la porte pour toutes les conditions expérimentales. L’expression du marqueur d’activation plaquettaire en réponse à l’application de la force de cisaillement n’est pas réglementée d’une manière dépendante du temps. Ici, des readouts représentatifs de l’activation humaine de plaquette en présence de deux anticorps ciblant le domaine N-terminal de glycoprotéine 1b-IX et d’un anticorps de contrôle dans des conditions cisaillées et statiques sont montrés.
L’expression des trois marqueurs d’activation a été sensiblement augmentée en présence des forces de cisaillement et des anticorps de ciblage, comparés aux conditions statiques ou en présence des anticorps de contrôle. Notamment, le traitement par anticorps avec une force non contraignante trop faible pour déclencher l’activation de la glycoprotéine 1b-IX ne déclenche pas l’upregulation du marqueur d’activation plaquettaire dans des conditions statiques ou de force de cisaillement. En outre, le plasma des patients immunisés de thrombocytopenia contenant des anticorps contre la glycoprotéine 1b-IX déclenchent des réponses dépendantes de cisaillement en contraste avec le plasma des patients sans anticorps de ciblage de glycoprotéine 1b-IX.
En plus des analyses flowcytométriques, les cellules qui ont été exposées au cisaillement peuvent également être lysées pour la tache occidentale, ELISA, et l’analyse de masse-spec pour déterminer n’importe quels changements dans le niveau de protéine. Comme toujours, lors de l’utilisation d’échantillons de sang ou d’échantillons humains, assurez-vous de porter l’équipement de protection approprié et de suivre les directives de sécurité de laboratoire et d’agent pathogène né dans le sang de votre établissement.
