このプロトコルは、せん断が解中の細胞に作用する方法に関する様々な質問に答えることを可能にし、せん断の持続時間と大きさを大幅に制御します。固定化された細胞に対するせん断の効果を検出する他の技術とは異なり、この技術は溶液中の細胞にせん断を適用することを可能にし、下流のシグナル検出方法のスペクトルに適しています。同意から末梢血を得た後、クエン酸三ナトリウム3.8%の4.5ミリリットルチューブで健康な成人ドナー、血小板が豊富な血漿を得るために血液を遠心分離し、得られた上、曇り、黄色の血小板を含む血漿層を慎重に除去するために45度の角度で切断されたピペット先端を使用する。
血小板数を完全な血球数で得て、血小板数を約2.5倍に調整し、ミクロリットル当たり5番目の血小板を、プールされたヒト血小板不良血漿で調整します。その後、サスペンションを穏やかな回転で摂氏22度に置きます。リガンド処理では、対象となる抗体またはリガンドを血小板が豊富な血漿にゆっくりと加え、血小板を軽く混ぜます。
インキュベーション中にコーンプレート粘度計をオンにし、プレート温度を摂氏22度に設定します。5~10分後、処理した血小板を多く含むプラズマをプレートの中央にある温度制御コーンプレート粘度計に直接移し、接触点で全ての試料がコーンとプレートの間に堆積するように注意します。サンプルにせん断を適用するには、粘度計マニュアルに従ってせん断を計算し、適切な速度と持続時間でサンプルにせん断を適用します。
塗布の最後に、プレートから約2ミリメートル離れた円錐を持ち上げ、サンプルがプレートと円錐の両方に接触したままになるようにし、ゲルローディングピペットチップを使用してサンプルボリュームの中心から5〜10マイクロリットルを収集します。次に、目的の表面マーカーに対する抗体を用いた分離サンプルを室温で20分間インキュベートし、室温で2%パラホルムアルデヒドでサンプルを2%固定します。フローサイトメトリーでサンプルを解析するには、各条件について少なくとも20,000個の事象を収集し、各蛍光マーカーの信号強度を定量化し、各フルオロフォアの強度の高さ値を用いた。
次に、ウシ血清アルブミンまたは車両で陰性コントロールを使用して、陰性バックグラウンド蛍光イベントを除くゲートを描画し、すべての実験条件についてゲート内の事象の割合を定量化します。せん断力適用に応答した血小板活性化マーカー式は時間依存的に調節されない。ここで、糖タンパク質1b−IXのN末端ドメインを標的とする2つの抗体と、1つの対照抗体をせんくりと静的条件下で標的とするヒト血小板活性化の代表的な読み出しが示されている。
3つの活性化マーカーの発現は、静常条件または対照抗体の存在と比較して、せん断力および標的化抗体の存在下で有意に増加した。特に、結合不可能な力が低すぎて糖タンパク質1b-IX活性化を引き起こさない抗体による治療は、静的または剪断力条件下で血小板活性化マーカーのアップレギュレーションを引き起こさない。また、糖タンパク質1b-IXに対する抗体を含む免疫血小板減少症患者からの血漿は、糖タンパク質1b-IX標的抗体を有さない患者からの血漿とは対照的に、剪断依存応答を引き起こす。
流量測定分析に加えて、せん断に曝された細胞は、ウェスタンブロット、ELISA、マススペック分析のために分解してタンパク質レベルの変化を決定することもできます。いつものように、血液や人間のサンプルを使用する場合は、適切な保護具を着用し、あなたの機関のラボの安全性と血液生まれの病原体のガイドラインに従ってください。
