Bu protokol, kesmenin çözümdeki hücreler üzerinde nasıl hareket ettiği yle ilgili çeşitli soruları yanıtlamamıza olanak tanır ve kesme süresi ve büyüklüğü üzerinde önemli bir kontrol sağlar. Makası hareketsiz hale getiren hücreler üzerindeki etkisini algılayan diğer tekniklerin aksine, bu teknik, solüsyondaki hücrelere kesme uygulamamızı sağlar ve kendini aşağı akım sinyal algılama yöntemlerinin bir spektrumuna verir. %3,8 trisodyum sitrat içeren 4,5 mililitrelik tüpte, sağlıklı yetişkin bir donörden periferik kan aldıktan sonra, trombosit açısından zengin plazma elde etmek için kanı santrifüj edin ve elde edilen üst, bulutlu, sarı trombosit açısından zengin plazma tabakasını dikkatlice çıkarmak için 45 derecelik açıyla kesilen pipet ucunu kullanın.
Tam kan sayımı ile trombosit sayısını elde edin ve trombosit sayısını yaklaşık 2,5 kez 10'a, mikrolitre başına, havuzlu insan trombosit-zayıf plazmaile beşinci trombositlere ayarlayın. Daha sonra, hafif bir dönüş ile 22 santigrat derece süspansiyon yerleştirin. Ligand tedavisi için trombosit açısından zengin plazmaya antikor veya ligand'ı yavaşça ekleyin ve trombositleri hafifçe karıştırın.
Kuluçka sırasında, koni plakalı viscometer açın ve 22 santigrat derece plaka sıcaklığı ayarlayın. 5-10 dakika sonra, tedavi trombosit açısından zengin plazmayı doğrudan plakanın ortasındaki sıcaklık kontrollü koni plakalı viscometer'a aktarın ve tüm numunenin temas noktasında koni ile plaka arasında birikintisi göz önünde bulundurulmasını sağlar. Makası örneğe uygulamak için, makaslamayı viscometer kılavuzuna göre hesaplayın ve makaslamayı uygun oranda ve süreyle numuneye uygulayın.
Uygulamanın sonunda, numunenin hem plaka yla hem de koniyle temas halinde kalması için koniyi plakadan yaklaşık iki milimetre kaldırın ve numune hacminin merkezinden beş ila 10 mikrolitre toplamak için jel yükleme pipet ucu kullanın. Daha sonra sheared numunesini oda sıcaklığında 20 dakika boyunca ilgi yüzey belirteçlerine karşı antikorlarla kuluçkaya yatırın ve numuneleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca %2 paraformaldehit le sabitleyin. Akış sitometrisi ile örnekleri analiz etmek için, her koşul için en az 20.000 olay toplamak ve her floresan belirteç sinyal gücünü ölçmek, her florofor yoğunluğu için yükseklik değerini kullanarak.
Daha sonra negatif arka plan floresan olayları hariç, bir kapı çizmek için büyükbaş serum albumin veya araç ile negatif bir kontrol kullanın ve tüm deneysel koşullar için kapı içinde olayların yüzdesini ölçmek. Kesme kuvveti uygulamasına yanıt olarak trombosit aktivasyon marker ekspresyonu zamana bağlı bir şekilde düzenlenmemiştir. Burada glikoprotein 1b-IX'un N-terminal etki alanını hedefleyen iki antikor varlığında insan trombosit aktivasyonunun temsili okumaları ve yığılmalı ve statik koşullar altında bir kontrol antikorları gösterilmiştir.
Her üç aktivasyon belirteçlerinin ekspresyonu, ya statik koşullara ya da kontrol antikorlarının varlığına kıyasla kesme kuvvetleri nin varlığında ve antikorları hedef alarak önemli ölçüde artırıldı. Özellikle, glikoprotein 1b-IX aktivasyonunu tetikleyemeyecek kadar düşük bağlayıcı olmayan bir kuvvetle antikor ile tedavi, statik veya kesme kuvveti koşullarında trombosit aktivasyon markerinin düzenlenmesini tetiklemez. Ayrıca, glikoprotein 1b-IX'a karşı antikor içeren immün trombositopeni hastalarından alınan plazma, glikoprotein 1b-IX hedefleyen antikorları olmayan hastalardan gelen plazmanın aksine makas bağımlı yanıtları tetikler.
Akış sitometrik analizlere ek olarak, kesmeye maruz kalan hücreler de protein düzeyindeki değişiklikleri belirlemek için batı leke, ELISA ve kütle-spec analizi için lysed olabilir. Her zaman olduğu gibi, kan veya insan örnekleri kullanırken, uygun koruyucu ekipman giymek ve kurumunuzun laboratuvar güvenliği ve kan doğan patojen yönergeleri takip emin olun.
