该协议，体外入侵测定，是一个有用的工具，定量测量细胞线的能力，通过蛋白质丰富的基质迁移，并通过多孔膜，这个过程类似于癌细胞入侵的早期阶段。这些细胞系可以进行基因改变，以便过度表达基因或减少基因的表达，以确定该基因在细胞迁移或细胞入侵中是否发挥作用。许多侵略性癌症涉及细胞行为的戏剧性变化，包括增加迁移和入侵。
因此，这种体外入侵分析可以让我们更好地了解这个过程所涉及的基因和其他因素。为了开始这个程序，在T25烧瓶中生长粘附的小鼠乳腺肿瘤细胞，在37摄氏度下，有5%的二氧化碳和100%的湿度，直到它们在第一天被70%到90%的汇合。从存储中取回博伊登腔室插入物，并将其转移到细胞培养罩中，以加热至室温 20 分钟。
使用三个插入来为每个实验的每个单元格行生成统计上有效的数据。然后将500微升的预加热无血清DMEM介质添加到刀片中，使多孔膜和凝胶在两侧进行水合。在37摄氏度下孵育，用5%的二氧化碳和100%的湿度孵育至少两个小时。
在此之后，通过去除生长介质和用五毫升的HSS冲洗细胞来准备细胞。取出 HBSS 并添加 0.25% trypsin EDTA 溶液的一毫升。在37摄氏度下孵育一至五分钟，或直到细胞出现圆形或出现分离迹象。
然后轻轻敲拍烧瓶，分离所有细胞。用10%FBS将细胞重新悬浮在5毫升DMEM中。将细胞悬浮液转移到无菌的15毫升离心管。
离心细胞和1000倍g5分钟，轻轻地颗粒细胞。取出介质，将颗粒重新悬浮在五毫升无血清 DMEM 中。重复离心和重新悬挂过程两次，总共洗三次。
在此之后，彻底重新悬浮在无血清DMEM的最后五毫升细胞，并确保没有细胞团。使用血细胞计确定细胞浓度，确保只计算可行细胞。在5毫升无血清DMEM中稀释细胞悬浮液至每毫升5万个细胞。
接下来，将带刀片的盘子从培养箱中取出，然后轻轻地从刀片中吸出介质。提起刀片，从井中吸出介质。快速工作，将化疗法添加到下院。
将刀片放入井中，对于 24 个井盘，向刀片中加入 500 微升的电池悬浮液。确保膜两侧没有气泡。将菜返回细胞培养箱22小时。
22 小时后，准备 1% 甲醛溶液和一个 X PBS 进行固定。在干净的24孔细胞培养皿中，将一毫升的固定剂添加到单个孔中，以便每个插入有一口井。然后，用10%乙醇在PBS溶液中准备0.1%水晶紫罗兰的染色溶液。
将一毫升的染色溶液添加到每个刀片的清洁井中。使用钳子，一次卸下每个插入件。将无菌棉签放在每个刀片内，并拭子在膜的上侧，以去除任何未移民的细胞。
使用第二个棉签重复此过程。接下来，从刀片内部取出任何剩余的介质，并添加 750 微升 PBS 以洗去任何分离的电池。取出 PBS，用新鲜的 PBS 重复洗涤。
然后将刀片放入含有固定物的井中，以固定膜底面的迁移细胞。对所有刀片重复此过程，让刀片在室温下固定 15 分钟。在此之后，从井中每次取出一个刀片，然后用 750 微升 PBS 清洗。
将刀片放入含污渍溶液的井中，并留15分钟，以染色所有迁移和固定的细胞。然后取出刀片，浸入装有蒸馏水的烧杯中，直到从刀片上流下来的水清除。清除多余的水滴，侧身将插入物放在一张滤纸上。
让刀片空气干燥。通过为每个刀片标记干净的玻璃显微镜幻灯片，并将一小滴显微镜浸入油放入每个幻灯片的中心，为成像做好准备。使用手术刀，在塑料插入件内侧膜的周长周围切割膜，以分离膜。
使用钳子取出膜并将其放在标记的滑轨上的油滴顶部。使用复合显微镜，以五倍、十倍或二十倍的放大率观察细胞。要进行量化，请以 10 倍的放大倍率拍摄多个非重叠图像。
确定所有样本每个区域的入侵细胞或细胞总数。对于每个实验，使用三个复制插入执行测定中的每个条件，并重复多次，以取得统计上有用的结果。在这项研究中，通过蛋白质基质进行体外入侵，用于评估小鼠乳腺肿瘤细胞的恶性表型，并改变锌指蛋白Zc3h8的表达。
Zc3h8表达水平较高，出现在肿瘤细胞系或从质粒中通过启动子中表达，导致细胞增殖速度迅速，迁移速度快，3D环境中生长，并在体外入侵测定中增加侵蚀。相反，shRNA构造的表达减少会导致攻击性降低、迁移和入侵。当细胞入侵在Zc3h8表达的shRNA敲击时减少时，当表达被救出时，这种入侵被拯救。
体外入侵测定技术是非常有用的，因为它是一种快速，廉价，灵活，相对容易的方法研究细胞行为。培养中的细胞很容易在基因上操作。他们甚至可以测试特定的突变。
体外入侵系统还允许分析小分子抑制剂以及微生物制剂，如微RNA，以了解其对细胞迁移和入侵的影响。这种测定还包括很大的灵活性，允许改变基质的蛋白质含量，孔径和化疗。
