هذا البروتوكول، مقايسة الغزو في المختبر، هو أداة مفيدة لقياس كمية الخلايا خطوط القدرة على الهجرة من خلال مصفوفة غنية بالبروتين والمرور من خلال غشاء مسامية، في عملية مماثلة للمراحل المبكرة من غزو الخلايا السرطانية. ويمكن تغيير هذه الخطوط الخلوية وراثياً من أجل التعبير عن جين أو تقليل التعبير عن جين من أجل تحديد ما إذا كان هذا الجين يلعب دوراً في هجرة الخلايا أو غزو الخلايا. العديد من أنواع السرطان العدوانية تنطوي على تغييرات جذرية في سلوك الخلايا، بما في ذلك زيادة الهجرة والغزو.
لذا هذا الفحص في الغزو المختبري يمكن أن يسمح لنا بفهم الجينات والعوامل الأخرى التي تشارك في هذه العملية بشكل أفضل. لبدء هذا الإجراء، تنمو الخلايا السرطانية الماوس أتباع ماماري في قارورة T25 في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون والرطوبة 100٪حتى تكون 70٪ إلى 90٪ التقاء لليوم الأول من التجربة. استرداد إدراج غرفة Boyden من التخزين ونقلها إلى غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية إلى الحارة إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
استخدم ثلاثة إدراجات لإنشاء بيانات صالحة إحصائياً لكل خط خلية لكل تجربة. ثم إضافة 500 ميكرولترات من وسائل الإعلام DMEM المصل الخالية من قبل إلى إدراج بحيث يتم ترطيب الغشاء المسامية وهلام على كلا الجانبين. احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون والرطوبة 100٪ لمدة ساعتين على الأقل.
بعد ذلك، قم بإعداد الخلايا عن طريق إزالة وسائط النمو وشطف الخلايا بخمسة ملليلترات من HBSS. إزالة HBSS وإضافة ملليلتر واحد من 0.25٪ تريبسين EDTA الحل. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة دقيقة إلى خمس دقائق أو حتى تظهر الخلايا مدورة أو تظهر علامات الانفصال.
ثم اضغط بلطف على القارورة لفصل جميع الخلايا. إعادة تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من DMEM مع 10٪ FBS. ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر معقمة.
الطرد المركزي الخلايا و1000 مرات ز لمدة خمس دقائق ل بيليه بلطف الخلايا. إزالة وسائل الإعلام وإعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من DMEM خالية من المصل. كرر عملية الطرد المركزي وإعادة تعليق مرتين إضافية لمجموع ثلاثة يغسل.
بعد هذا، بدقة إعادة تعليق الخلايا في المليلتر الخمسة النهائي من DMEM خالية من المصل وضمان عدم وجود كتل من الخلايا. استخدم مقياس الهيموسيت لتحديد تركيز الخلية مع التأكد من عد الخلايا القابلة للحياة فقط. وتمييع تعليق الخلية إلى 50،000 خلية لكل ملليلتر في خمسة ملليلتر من DMEM خالية من المصل.
بعد ذلك، قم بإزالة الطبق مع إدراج من الحاضنة، وتبخر بلطف وسائل الإعلام من إدراج. ارفعي إدراج الوسائط من البئر. العمل بسرعة، إضافة العلاج الكيميائي إلى الغرفة السفلى.
وضع إدراج في البئر، ولطبق 24 جيدا، إضافة 500 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى إدراج. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء على جانبي الغشاء. إعادة الطبق إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 22 ساعة.
بعد 22 ساعة، وإعداد حل من 1٪ شبه شكلي واحد وX برنامج تلفزيوني لتثبيت. في طبق ثقافة نظيف 24 خلية جيدا، إضافة ملليلتر واحد من المثبت إلى الآبار الفردية حتى لا يكون هناك بئر واحد لكل إدراج. ثم، وإعداد حل تلطيخ من البنفسج الكريستال 0.1٪ في حل من برنامج تلفزيوني مع الإيثانول 10٪.
إضافة ملليلتر واحد من هذا الحل تلطيخ إلى بئر نظيفة لكل إدراج. باستخدام ملقط، إزالة كل إدراج واحد في وقت واحد. ضع مسحة قطنية معقمة داخل كل إدراج ومسحة الجانب العلوي من الغشاء لإزالة أي خلايا غير مشوشة.
كرر هذه العملية مع مسحة القطن الثانية. بعد ذلك، قم بإزالة أي وسائط متبقية من داخل إدراج وإضافة 750 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني لغسل أي خلايا منفصلة. إزالة برنامج تلفزيوني وتكرار غسل مع برنامج تلفزيوني جديد.
ثم ضع إدراج في إصلاح يحتوي على تثبيت لإصلاح الخلايا المهاجرة على الجانب السفلي من الغشاء. كرر هذه العملية لجميع إدراج والسماح للإدخال إصلاح لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، إزالة كل إدراج واحد في وقت واحد من بئره وغسله مع 750 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.
ضع إدراج في بئر تحتوي على حل تلطيخ وتركها لمدة 15 دقيقة لطخة جميع الخلايا التي تم ترحيلها وثابتة. ثم إزالة إدراج وتراجع لهم في منقار يحتوي على الماء المقطر حتى المياه التي تجري قبالة إدراج واضح. إزالة أي قطرات الماء الزائدة ووضع إدراج جانبية على قطعة من ورقة مرشح.
اسمحوا إدراج الهواء الجاف. إعداد الغشاء للتصوير عن طريق وضع علامة على شريحة مجهر الزجاج نظيفة لكل إدراج، ووضع قطرة صغيرة من زيت الغمر المجهر في وسط كل شريحة. باستخدام مشرط، وقطع حول محيط الغشاء على داخل إدراج البلاستيك لفصل الغشاء.
استخدام ملقط لإزالة الغشاء ووضعها على رأس قطرة النفط على الشريحة المسمى. باستخدام المجهر المركب، عرض الخلايا في خمس مرات، 10 مرات، أو 20 مرة التكبير. للحصول على القياس الكمي، يمكنك التقاط صور متعددة غير متداخلة عند التكبير 10 مرات.
تحديد العدد الإجمالي للخلايا الغازية أو الخلايا في كل منطقة لجميع العينات. لكل تجربة، قم بتنفيذ كل شرط في المقايسة مع ثلاثة إدراجات مكررة وكرر عدة مرات للحصول على نتائج مفيدة إحصائياً. في هذه الدراسة، في المختبر الغزو من خلال مصفوفة البروتين يستخدم لتقييم الأنماط الظاهرية العدوانية في سلوكيات الخلايا oncogenics من الخلايا الماوس ماماري الخلايا السرطانية مع التعبير المتغيرة من البروتين إصبع الزنك، Zc3h8.
وينظر إلى مستويات أعلى من التعبير Zc3h8 في خطوط الخلايا السرطانية أو عن طريق التعبير عن طريق المروج بوساطة من plasmid، مما أدى إلى معدلات سريعة لانتشار الخلايا، والهجرة السريعة، والنمو في بيئات 3D، وزيادة التعدي داخل مقايسة الغزو في المختبر. وعلى العكس من ذلك، فإن انخفاض التعبير عن طريق SHRNA يؤدي إلى انتشار أقل عدوانية والهجرة والغزو. في حين أن غزو الخلية يقلل على ضربة قاضية من التعبير Zc3h8، يتم إنقاذ هذا الغزو عندما يتم إنقاذ التعبير.
تقنية فحص الغزو في المختبر مفيد للغاية لأنه نهج سريع وغير مكلف ومرنة وسهلة نسبيًا لدراسة سلوك الخلية. الخلايا التي تزرع في الثقافة من السهل التلاعب وراثيا. بل يمكن اختبارها للكشف عن طفرات محددة.
كما يسمح نظام الغزو في المختبر لتحليل مثبطات الجزيئات الصغيرة وكذلك العوامل البيولوجية مثل RNAs الصغيرة لآثارها على هجرة الخلايا والغزو. هذا الفحص يشمل أيضا قدرا كبيرا من المرونة، والسماح لتغيير محتوى البروتين من المصفوفة، وحجم المسام وchemoattractant.
