Этот протокол, анализ вторжения in vitro, является полезным инструментом для количественного измерения способности клеток мигрировать через богатую белком матрицу и проходить через пористую мембрану, в процессе, похожем на ранние стадии вторжения раковых клеток. Эти клеточные линии могут быть генетически изменены для того, чтобы выразить ген или уменьшить экспрессию гена, чтобы определить, играет ли этот ген роль в миграции клеток или вторжении клеток. Многие агрессивные раковые заболевания связаны с резкими изменениями в поведении клеток, включая увеличение миграции и вторжения.
Так что это анализ вторжения в пробирке может позволить нам лучше понять гены и другие факторы, участвующие в этом процессе. Чтобы начать эту процедуру, расти адепт мыши молочных опухолевых клеток в колбе T25 при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислого газа и 100% влажности, пока они не 70%-90%confluent в течение дня один из экспериментов. Извлеките вставки камеры Boyden от хранения и перенесите их к капюшону культуры клетки для того чтобы прогреть к комнатной температуре на 20 минут.
Используйте три вставки для генерации статистически достоверных данных для каждой ячейки для каждого эксперимента. А затем добавьте 500 микролитров предварительно разогретых без сыворотки DMEM-средств массовой информации вставки так, чтобы пористые мембраны и гель увлажнялись с обеих сторон. Инкубация при 37 градусах Цельсия с 5%-ным углекислым газом и 100%humidity в течение по крайней мере двух часов.
После этого, подготовить клетки, удалив рост средств массовой информации и полоскания клеток с пятью миллилитров HBSS. Удалите HBSS и добавьте один миллилитр 0.25%trypsin EDTA решение. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение одной-пяти минут или до тех пор, пока клетки появляются округлые или проявляют признаки отслоения.
Затем осторожно нажмите на колбу, чтобы отсоединить все клетки. Повторно приостанавливать клетки в пяти миллилитров DMEM с 10%FBS. И перенесите подвеску клетки в стерильную 15-миллилитровую центрифугу.
Центрифуга клеток и 1000 раз г в течение пяти минут, чтобы аккуратно гранулировать клетки. Удалите средства массовой информации и повторно приостановить гранулы в пяти миллилитров сыворотки свободной DMEM. Повторите центрифугирование и повторно приостановив процесс еще два раза в общей сложности три моет.
После этого, тщательно повторно приостановить клетки в последние пять миллилитров сыворотки свободной DMEM и обеспечить Есть нет скопления клеток. Используйте гемоцитометр, чтобы определить концентрацию клеток убедившись, что только рассчитывать жизнеспособные клетки. И разбавить клеточной суспензией до 50 000 клеток на миллилитр в пяти миллилитров без сыворотки DMEM.
Затем снимите блюдо с вставками из инкубатора и аккуратно аспирировать средства массовой информации из вставки. Поднимите вставку и аспирировать средства массовой информации из колодец. Работая быстро, добавьте химиоатрактант в нижнюю палату.
Поместите вставку в колодец, а для 24 хорошо блюдо, добавить 500 микролитров клеточной подвески в вставку. Убедитесь, что по обе стороны мембраны нет пузырьков воздуха. Верните блюдо в инкубатор клеточной культуры в течение 22 часов.
Через 22 часа подготовьте раствор 1%paraformaldehyde и один X PBS для фиксации. В чистом 24 хорошо блюдо культуры клеток, добавить один миллилитр фиксатора для отдельных скважин, так что есть один хорошо для каждой вставки. Затем приготовьте окрашивающий раствор 0,1%кристаллического фиолетового в растворе PBS с 10%этанолом.
Добавьте один миллилитр этого окрашивания раствора в чистый колодец для каждой вставки. Используя хлипы, удалите каждую вставку по одному. Поместите стерильный ватный тампон внутри каждой вставки и мазок верхней стороне мембраны, чтобы удалить любые незагрясню клетки.
Повторите этот процесс со вторым ватным тампоном. Затем удалите оставшиеся средства массовой информации из внутренней части вставки и добавьте 750 микролитров PBS, чтобы смыть любые отдельные клетки. Удалите PBS и повторите стирку со свежим PBS.
Затем поместите вставку в хорошо содержащий фиксатор, чтобы исправить мигрировавшие клетки на нижней стороне мембраны. Повторите этот процесс для всех вставок и пусть вставки исправить в течение 15 минут при комнатной температуре. После этого, удалить каждую вставку по одному из его хорошо и мыть его с 750 микролитров PBS.
Поместите вставку в хорошо содержащий окрашивание раствор и оставьте его на 15 минут, чтобы испачкать все мигрировавшие и фиксированные клетки. Затем снимите вставки и окуните их в стакан, содержащий дистиллированную воду, пока вода, убегая от вставки не станет ясной. Удалите излишки капель воды и поместите вставку боком на лист фильтровальной бумаги.
Пусть вставки воздух сухой. Подготовьте мембрану для визуализации, обозначив чистый стеклянный микроскоп слайд для каждой вставки, и размещение небольшой капли микроскопа погружения нефти в центре каждого слайда. Используя скальпель, вырезать по периметру мембраны на внутренней стороне пластиковой вставки, чтобы отделить мембрану.
Используйте типсы, чтобы удалить мембрану и поместить его на верхней части капли масла на помечены слайд. Используя сложный микроскоп, просмотрите клетки в пять раз, в 10 раз или в 20 раз больше. Для количественной оценки возьмите несколько некрывающихся изображений при увеличении в 10 раз.
Определите общее количество вторгшихся ячеек или ячеек в области для всех образцов. Для каждого эксперимента, выполнить каждое условие в анализе с тремя вставками репликации и повторить несколько раз для статистически полезных результатов. В этом исследовании, вторжение в пробирке через белковую матрицу используется для оценки агрессивных фенотипов в онкогенных клеточных поведениях клеток опухоли молочной железы мыши с измененным выражением белка цинкового пальца, qc3h8.
Более высокие уровни экспрессии qc3h8 видны в линиях опухолевых клеток или промоутером опосредованного выражения плазмиды, что приводит к быстрым темпам распространения клеток, быстрой миграции, росту в 3D-средах и усилению посягательств в пределах анализа вторжения в пробирку. И наоборот, снижение экспрессии shRNA приводит к менее агрессивному распространению, миграции и вторжению. В то время как вторжение ячейки уменьшается на шРНК нокдауна выражения qc3h8, это вторжение спасено, когда выражение спасено.
Метод анализа вторжения в пробирке чрезвычайно полезен, так как это быстрый, недорогой, гибкий и относительно простой подход к изучению поведения клеток. Клетки, выращенные в культуре, легко манипулировать генетически. Они даже могут быть проверены на конкретные мутации.
Система вторжения в пробирку также позволяет проводить анализ малых ингибиторов молекул, а также биологических агентов, таких как микроРНК, для их воздействия на миграцию клеток и вторжение. Этот анализ также включает в себя большое количество гибкости, что позволяет изменение содержания белка в матрице, размер поры и хемоаттрактант.
