Ce protocole, l’analyse d’invasion in vitro, est un outil utile pour mesurer quantitativement la capacité d’une lignée cellulaire à migrer à travers une matrice riche en protéines et à passer à travers une membrane poreuse, dans un processus similaire aux premiers stades de l’invasion des cellules cancéreuses. Ces lignées cellulaires peuvent être génétiquement modifiées afin de sur-exprimer un gène ou d’avoir une expression réduite d’un gène afin de déterminer si ce gène joue un rôle dans la migration cellulaire ou l’invasion cellulaire. De nombreux cancers agressifs impliquent des changements spectaculaires dans le comportement cellulaire, y compris l’augmentation de la migration et l’invasion.
Ainsi, cet essai d’invasion in vitro peut nous permettre de mieux comprendre les gènes et autres facteurs impliqués dans ce processus. Pour commencer cette procédure, cultiver des cellules tumorales mammaires de souris adhérentes dans un flacon T25 à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone et 100% d’humidité jusqu’à ce qu’ils soient 70% à 90% confluent pour le premier jour de l’expérience. Récupérez les inserts de chambre Boyden de stockage et transférez-les à une hotte de culture cellulaire pour réchauffer à température ambiante pendant 20 minutes.
Utilisez trois inserts pour générer des données statistiquement valides pour chaque lignée cellulaire pour chaque expérience. Et puis ajouter 500 microlitres du sérum préchauffé sans DMEM médias aux inserts de sorte que la membrane poreuse et le gel sont hydratés des deux côtés. Incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone et 100% d’humidité pendant au moins deux heures.
Après cela, préparer les cellules en enlevant le média de croissance et en rinçant les cellules avec cinq millilitres de HBSS. Retirez le HBSS et ajoutez un millilitre de 0,25% trypsine EDTA solution. Incuber à 37 degrés Celsius pendant une à cinq minutes ou jusqu’à ce que les cellules apparaissent arrondies ou montrent des signes de détachement.
Puis appuyez doucement sur le flacon pour détacher toutes les cellules. Suspendre à nouveau les cellules en cinq millilitres de DMEM avec 10%FBS. Et transférer la suspension cellulaire dans un tube stérile centrifugeuse de 15 millilitres.
Centrifuger les cellules et 1000 fois g pendant cinq minutes pour pelleter doucement les cellules. Retirez le média et suspendez la pastille en cinq millilitres de DMEM sans sérum. Répétez le processus de centrifugation et de re-suspension deux fois supplémentaires pour un total de trois lavages.
Après cela, soigneusement re-suspendre les cellules dans les cinq derniers millilitres de DMEM sans sérum et s’assurer qu’il n’y a pas de touffes de cellules. Utilisez un hémocytomètre pour déterminer la concentration cellulaire en vous assurant de ne compter que les cellules viables. Et diluer la suspension cellulaire à 50 000 cellules par millilitre en cinq millilitres de DMEM sans sérum.
Ensuite, retirez le plat avec les inserts de l’incubateur, et aspirez doucement le média d’un insert. Soulevez l’insert et aspirez les supports du puits. En travaillant rapidement, ajouter le chimioattractant à la chambre basse.
Placez l’insert dans le puits, et pour un plat de 24 puits, ajouter 500 microlitres de la suspension cellulaire à l’insert. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air présentes de chaque côté de la membrane. Remettre le plat à l’incubateur de culture cellulaire pendant 22 heures.
Après 22 heures, préparer une solution de 1% de paraformaldéhyde et un X PBS pour la fixation. Dans un plat propre de culture de cellules de 24 puits, ajoutez un millilitre du fixatif aux puits individuels ainsi il y a un puits pour chaque insert. Ensuite, préparez la solution de coloration de 0,1% de violet cristal dans une solution de PBS avec 10% d’éthanol.
Ajoutez un millilitre de cette solution de coloration à un puits propre pour chaque insert. À l’aide de forceps, retirez chaque insert un à la fois. Placez un coton-tige stérile à l’intérieur de chaque insert et écouvillonnez le côté supérieur de la membrane pour enlever les cellules non mélangées.
Répétez ce processus avec un deuxième coton-tige. Ensuite, retirez tout autre média de l’intérieur de l’insert et ajoutez 750 microlitres de PBS pour laver les cellules détachées. Retirer le PBS et répéter le lavage avec du PBS frais.
Ensuite, placez l’insert dans un puits contenant fixatif pour fixer les cellules migrées sur le dessous de la membrane. Répétez ce processus pour tous les inserts et laissez les inserts fixer pendant 15 minutes à température ambiante. Après cela, retirez chaque insert un à la fois de son puits et lavez-le avec 750 microlitres de PBS.
Placez l’insert dans une solution de coloration contenant bien et laissez-le pendant 15 minutes pour tacher toutes les cellules migrées et fixes. Retirez ensuite les inserts et trempez-les dans un bécher contenant de l’eau distillée jusqu’à ce que l’eau qui s’enfuit de l’insert soit claire. Retirer les gouttelettes d’eau excédentaires et placer l’insert latéralement sur un morceau de papier filtre.
Laissez sécher l’air des inserts. Préparez la membrane à l’imagerie en étiquetant une lame de microscope en verre propre pour chaque insert, et en plaçant une petite goutte d’huile d’immersion au microscope au centre de chaque diapositive. À l’aide d’un scalpel, couper autour du périmètre de la membrane à l’intérieur de l’insert en plastique pour détacher la membrane.
Utilisez des forceps pour enlever la membrane et la placer sur la goutte d’huile sur la lame étiquetée. À l’aide d’un microscope composé, visualisez les cellules à cinq fois, 10 fois ou 20 fois le grossissement. Pour la quantification, prenez plusieurs images qui ne se chevauchent pas à 10 fois le grossissement.
Déterminer le nombre total de cellules envahissantes ou de cellules par zone pour tous les échantillons. Pour chaque expérience, effectuez chaque condition dans l’analyse avec trois inserts de répétition et répétez plusieurs fois pour des résultats statistiquement utiles. Dans cette étude, l’invasion in vitro par une matrice protéique est utilisée pour évaluer les phénotypes agressifs dans les comportements cellulaires oncogènes des cellules tumorales mammaires de souris avec l’expression altérée de la protéine de doigt de zinc, Zc3h8.
Des niveaux plus élevés d’expression Zc3h8 sont observés dans les lignées cellulaires tumorales ou par l’expression médiatisée d’un plasmide, ce qui entraîne des taux rapides de prolifération cellulaire, une migration rapide, une croissance dans les environnements 3D et un empiétement accru dans l’analyse d’invasion in vitro. Inversement, la diminution de l’expression par shRNA se traduit par une prolifération, une migration et une invasion moins agressives. Alors que l’invasion cellulaire diminue lors du renversement shRNA de l’expression Zc3h8, cette invasion est sauvée lorsque l’expression est sauvée.
La technique d’analyse d’invasion in vitro est extrêmement utile car il s’agit d’une approche rapide, peu coûteuse, flexible et relativement facile à étudier le comportement cellulaire. Les cellules cultivées en culture sont faciles à manipuler génétiquement. Ils peuvent même être testés pour des mutations spécifiques.
Le système d’invasion in vitro permet également l’analyse des inhibiteurs des petites molécules ainsi que des agents biologiques comme les micro ARN pour leurs effets sur la migration et l’invasion cellulaires. Cet essai inclut également une grande quantité de flexibilité, permettant l’altération de la teneur en protéines de la matrice, de la taille des pores et du chimioattractant.
