このプロトコルは、インビトロ浸潤アッセイは、癌細胞浸潤の初期段階と同様のプロセスで、タンパク質豊富なマトリックスを透過し、多孔質膜を通過する細胞ライン能力を定量的に測定するための有用なツールである。これらの細胞株は、遺伝子を過剰発現させるために、または遺伝子の発現を減少させるために遺伝子を改変し、その遺伝子が細胞移動または細胞浸潤に役割を果たすかどうかを判断することができる。多くの積極的な癌は、移動と侵入の増加を含む細胞行動の劇的な変化を伴う。
したがって、このインビトロ侵入アッセイは、このプロセスに関与する遺伝子やその他の要因をよりよく理解することを可能にします。この手順を開始するには、T25フラスコの接着性マウス乳腺腫瘍細胞を摂氏37度で成長させ、5%の二酸化炭素と湿度100%で、実験の1日目に70%から90%コンフルエントになるまで増殖させる。ボイデンチャンバーのインサートを保管から取り出し、細胞培養フードに移して室温まで20分間温めます。
3 つの挿入を使用して、各実験の各セルラインに対して統計的に有効なデータを生成します。そして、多孔質膜とゲルが両側に水分補給されるように、挿入物に500マイクロリットルの事前温めた無血清DMEM培地を加えます。5%の二酸化炭素と100%の湿度で37°Cで少なくとも2時間インキュベートします。
この後、増殖培地を取り出し、5ミリリットルのHBSSで細胞をすすいで細胞を調製する。HBSSを取り外し、0.25%トリプシンEDTA溶液の1ミリリットルを加えます。摂氏37度で1~5分間、または細胞が丸みを帯びた状態に見えたり、剥離の兆候を示すまでインキュベートします。
その後、フラスコを軽くタップしてすべてのセルを取り外します。10%FBSで5ミリリットルのDMEMで細胞を再懸濁します。そして、無菌15ミリリットル遠心管に細胞懸濁液を移す。
遠心分離し、5分間gを1000回回とし、細胞を穏やかにペレット化する。培地を取り出し、ペレットを5ミリリットルの無血清DMEMで再懸濁します。遠心分離と再中断プロセスを2回繰り返し、合計3回のスケーションを行います。
この後、血清フリーDMEMの最後の5ミリリットルの細胞を徹底的に再懸濁し、細胞の塊がないことを確認します。ヘモサイトメーターを使用して、生存細胞のみをカウントするように細胞濃度を決定します。そして、細胞懸濁液を5ミリリットルの無血清DMEMで50,000細胞に希釈する。
次に、インキュベーターからインサートで皿を取り出し、挿入物からメディアを軽く吸引します。インサートを持ち上げ、井戸からメディアを吸引します。迅速に作業し、下の部屋に化学誘引剤を追加します。
インサートをウェルに入れ、24ウェル皿の場合は、500マイクロリットルのセルサスペンションをインサートに加えます。膜の両側に気泡がないことを確認します。22時間培養インキュベーターに皿を戻します。
22時間後、1%パラホルムアルデヒドと1 X PBSの溶液を調製して固定します。きれいな24ウェル細胞培養皿では、個々の井戸に固定液の1ミリリットルを追加して、挿入ごとに1つの井戸があります。次いで、10%エタノールを用いたPBSの溶液中に0.1%結晶バイオレットの染色液を調製した。
この染色液を1ミリリットル加えて、各インサートに対して清潔なウェルにします。鉗子を使用して、各挿入を一度に1つずつ取り外します。各インサートの中に無菌綿棒を入れ、膜の上側を振り回して、未移行の細胞を取り除きます。
このプロセスを2本目の綿棒で繰り返します。次に、挿入物の内側から残りの培地を取り除き、750マイクロリットルのPBSを加え、取り外した細胞を洗い流します。PBSを取り出し、新鮮なPBSで洗浄を繰り返します。
次に、挿入物を固定剤を含むウェルに入れ、膜の下側に移行した細胞を固定します。すべての挿入に対してこのプロセスを繰り返し、挿入物を室温で15分間修正します。この後、各インサートを井戸から1つずつ取り出し、750マイクロリットルのPBSで洗浄します。
インサートを染色液を含むウェルに入れ、15分間放置して、移行した細胞と固定細胞をすべて染色します。その後、インサートを取り出し、インサートから流れる水が透明になるまで蒸留水を含むビーカーに浸します。余分な水滴を取り除き、挿入物をフィルターペーパーの上に横向きに置きます。
挿入物を空気乾燥させます。各挿入物に対してきれいなガラス顕微鏡スライドにラベルを貼り付け、各スライドの中央に顕微鏡浸漬油の小さな滴を入れることによって、イメージング用の膜を準備します。メスを使用して、プラスチックインサートの内側の膜の周囲を切断して膜を取り外します。
鉗子を使用して膜を取り除き、ラベル付きスライドのオイルドロップの上に置きます。複合顕微鏡を用いて、細胞を5倍、10倍、または20倍の倍率で表示する。定量化の場合は、重なり合う画像を 10 倍の倍率で撮影します。
すべてのサンプルの領域あたりの侵入セルまたはセルの総数を決定します。各実験について、3つの反復挿入物でアッセイの各条件を実行し、統計的に有用な結果を得るには複数回繰り返す。本研究では、タンパク質マトリックスを介したインビトロ浸潤を用いて、ジンクフィンガータンパク質Zc3h8の発現変化を伴うマウス乳腺腫瘍細胞の腫瘍原性細胞挙動における積極的な表現型を評価する。
Zc3h8発現のより高いレベルは、腫瘍細胞株またはプラスミドからのプロモーター媒介発現に見られ、細胞増殖の迅速な速度、速い移動、3D環境での増殖、およびインビトロ浸潤アッセイ内の侵入の増加をもたらす。逆に、shRNA構築物による発現の低下は、より積極的な増殖、移動および浸潤をもたらす。Zc3h8発現のshRNAノックダウン時に細胞浸潤が減少する一方で、発現が救われるときその浸潤は救い出される。
in vitroの侵入アッセイ技術は、細胞の挙動を研究するための迅速で安価で柔軟で比較的簡単なアプローチであるため、非常に有用です。培養で増殖した細胞は、遺伝的に操作しやすい。それらは特定の突然変異のためにテストすることができる。
インビトロ浸潤システムは、細胞遊走や浸潤に及ぼす影響について、マイクロRNAのような生体剤と同様に低分子阻害剤の分析も可能にする。このアッセイはまた、マトリックス、孔サイズおよび化学誘引剤のタンパク質含有量の変化を可能にする、柔軟性の偉大な量を含む。
