这种方法为科学家研究影响女性生殖道内精子迁移和行为的环境遗传因素提供了工具。这种技术的主要优点来自C.elegans的透明表皮，它允许实验者能够轻松地可视化和记录活动物的精子运动。首先，使用由巴斯德移液器和铂线压扁的蠕虫采摘，以挑选 20 到 30 L4 级草本，并轻轻地将它们放在六厘米种子 NGM 板上。
在20摄氏度下孵育草本，28至30小时。接下来，制作一个男性染色板。使用玻璃搅拌杆的端子从种子板的细菌草坪上刮出大肠杆菌，并沉积到非种子 NGM 板的中心，制作一个直径为 5 到 7 毫米的食物点。
在 DMSO 中混合两个微升的一毫摩尔米托染料，在微离心管中混合 10 微升 M9 缓冲液。将所有米托染料溶液移到男性染色板上的食物点上。将盘子放在黑暗中晾干30分钟。
在显微镜下，在一个装有一到三天大的成年C.elegans的盘子里，用扇形的尾巴识别雄性。挑选大约100个雄性到男性染色板上的米托染料染色食物点。用铝箔包裹板，在16摄氏度下孵育过夜。
第二天，将染色的雄性转移到一个新的种子NGM板，以清除多余的米托染料染色细菌。将盘子保持黑暗，直到交配。要制作一个交配板，在非种子NGM板上，滴两微升厚大肠杆菌混合物。
等待大约 10 到 15 分钟，让厚厚的细菌干燥形成交配点。在等待交配板干燥时，将300微升（按体积三分素）混合1%重量，将300微升（按体积四分之二）混合，将900微升混合在一起，以体积四分之二醇混合，混合900微升。用量将0.1%的重量混合在一起。将 600 微升四醇/三分液溶液转移到手表玻璃上。将第一天采摘的 12 至 15 个赫马赫罗丁转移到手表玻璃上的四米索/三辛溶液中。
将 Petri 盘的下半部分放在手表玻璃上，防止其蒸发，并孵育 30 分钟以固定草本。接下来，从黑暗中取回含有染色雄性的种子NGM板，并在交配板上的干交配点上选取50至60个染色雄性。把盘子放在黑暗里。
在母体固定后，使用玻璃巴斯德移液器从手表玻璃上拾取固定化的草本石。避免在移液器的狭窄部分以外吸吮草本。将草本植物转移到非种子 NGM 板上。
尽可能多地去除液体，让多余的液体干燥。一旦所有可见的液体蒸发，将麻醉的草本动物转移到与染色的雄配点上。在黑暗中孵育30分钟，允许交配。
如果需要精子分布评估，将交配的母体转移到种子的NGM板，并允许它们休息一小时，然后安装进行可视化。要安装蠕虫以进行可视化，请先将四分之一醇/三分液溶液的 10 至 15 微升滴入准备好的 2% agarose 垫上，然后将配合的草本虫转移到垫上的溶液中。在蠕虫上放置盖玻片。
将幻灯片安装到配备荧光的直立显微镜上，并放置蠕虫，使外阴和一个精子都位于视野中。聚焦图像，聚焦精子的中心。检查 DIC 和 TRITC 通道的曝光情况。
在 DIC 中，内部蠕虫结构清晰可见。在TRITC中，单个精子是可见的，作为明显的pucta。获取每个子宫的DIC和荧光图像。
要捕获延时视频，请首先找到子宫内含有标记精子的草本体。在采集面板上，将图像采集间隔调整为 15 到 30 秒，将持续时间调整为每个子宫 10 到 20 分钟。然后，单击"运行"在 DIC 和 TRITC 通道中获取延时图像。
从一端的外阴和一端的精子开始，将子宫分成三个区域，包含外阴的区域和包含精子的第三区。手动计算子宫内每三分之一的精子数量，并报告每个区域中每个区域中的数字占整个子宫中精子总数的百分比。如有必要，使用查找表调整 TRITC 通道图像的信号强度，以便每个精子都可以可见和量化。
要跟踪延时图像中的精子，请使用斐济软件进行分析。使用生物格式导入功能将图像从一个延时序列导入为一个超堆栈。然后，单击插件、跟踪，然后单击手动跟踪。
在打开的对话框中，在"斐济"工具栏中选择"跟踪对象"工具。双击将被跟踪的精子。单击显示的绿色圆圈内，并拖动到所需位置。
再次单击圆圈。虚线绿线变成实心绿线。同时点击 Shift 和 L 键以打开跟踪模式。
移动到延时系列中的下一帧。要设置新帧中跟踪精子的新位置，请将鼠标悬停在新点上，然后按 A 键。跟踪器将显示在新位置，并出现一条线，连接跟踪器放置在上一帧中的位置。
对其余帧重复相同的过程。跟踪完成后，单击"跟踪对象"对话框中的"分析"以生成所需的数据。要计算速度，请将精子的总路径长度除以已用时间。
要计算矢量速度，请从外阴开始，指向精子，在子宫中画一条线。使用"线"工具测量精子从跟踪开始到结束沿这条线迁移的距离。将此距离除以已用时间。
负值表示精子已经远离精子。要记录反转频率，请计算精子轨迹在连续三个延时帧中产生小于 90 度角的时间。在该协议中，雾-2 q71雄性蠕虫被染色的米托染料，并交配到野生型N2草本。
成年草本生殖道有两只手臂，是彼此的镜像。交配后，贴有标签的精子通过外阴沉积在母体子宫中。精子在子宫内的发育胚胎周围移动，向精子中心移动，储存到受精。
草本子宫被分成三个区域，用于量化精子的分布和迁移。为了评估精子的速度和反转频率，只有第二区的精子通过延时图像进行跟踪。第一区的精子，从外阴开始，第三区，包括精子，倾向于以圆形模式移动。
以红点和蓝点为标志的精子有精子速度和反转频率量化。当量化子宫中的精子分布时，使用野生型N2草本和雾-2 q71雄性进行适当的精子指导，导致大约90%的标记精子到达精子。如果交配导致子宫精子太少或子宫精子太多，则不应计算数据，以填充每个缝隙。
重要的是，在每一个转移步骤中，动物要轻轻处理，动物被完全固定，含有米染的盘子和蠕虫被遮挡在光线中。此方法可与基因敲除或敲除实验、环境或化学暴露实验或其他操作相结合，以确定可能调节精子迁移的因素。这项技术使我们能够识别特定的前列腺素，这对引导精子到卵母细胞非常重要。
这些前列腺素是通过一种非常规机制合成的，这种机制可以在高等哺乳动物中保存。四分素，三辛，DMSO是皮肤和眼睛刺激物，可能有毒性作用在高剂量。处理任何化学品时，必须佩戴适当的防护装备。
