Этот метод предоставляет ученым инструмент для изучения экологических генетических факторов, влияющих на миграцию спермы и поведение в их родной среде внутри женского репродуктивного тракта. Основным преимуществом этой техники является прозрачный эпидермис C.elegans, который позволяет экспериментаторам легко визуализировать и записывать движение спермы у живых животных. Для начала используйте червь забрать из пастер пипетки и платиновой проволоки сплющенные на одном конце, чтобы выбрать от 20 до 30 L4 этапе гермафродитов, и аккуратно поместите их на шесть сантиметров семян NGM пластины.
Инкубировать гермафродиты при 20 градусах по Цельсию в течение 28 до 30 часов. Далее сделайте мужскую окрашивание пластины. Используйте конец стеклянного перемешивания стержня, чтобы соскребать E.coli от бактерий газон семенной пластины, и хранение его на центр несеяной пластины NGM, что делает пять-семь миллиметров диаметром пищевой точки.
Смешайте два микролитера одномимолярного мито-красителя в DMSO и 10 микролитров буфера M9 в микроцентрифугной трубке. Pipette все мито-краситель раствор на пищевой точкой на мужской окрашивания пластины. Поместите тарелку в темноту, чтобы высохнуть в течение 30 минут.
Под микроскопом, на тарелке, содержащей от одного до трех дней взрослых C.elegans, определить мужчин по их веерообразный хвост. Выберите около 100 мужчин к мито-краситель окрашенных пищевой точкой на мужской окрашивания пластины. Оберните пластину в алюминиевую фольгу и инкубировать на ночь при 16 градусах по Цельсию.
На второй день, передача окрашенных мужчин на новый семенной пластины NGM, чтобы очистить избыток мито-красителя окрашенных бактерий. Держите тарелку в темноте до спаривания. Чтобы сделать брачную пластину, на несеяной пластине NGM, капать два микролитров толстой смеси E.coli.
Подождите примерно от 10 до 15 минут, пока толстые бактерии высохнут, чтобы сформировать брачное дело. В ожидании спаривания пластины высохнуть, смешать 300 микролитров 1% веса по объему tricaine, 300 микролитров 0,1% веса по объему теттрамизола, и 900 микролитров M9. Перенесите 600 микролитров раствора теттрамизола/tricaine в часовое стекло. Передача от 12 до 15 гермафродитов, выбранных в первый день в раствор теттрамизола/трикаина на часовом стекле.
Поместите нижнюю половину чашки Петри над стеклом часов, чтобы она была покрыта от испарения, и инкубировать в течение 30 минут, чтобы обездвижить гермафродиты. Далее, получить семенами NGM пластины, которая содержит окрашенных самцов из темноты, и выбрать от 50 до 60 окрашенных мужчин на сушеные точки спаривания на спаривания пластины. Храните тарелку в темноте.
После того, как гермафродиты обездвижены, используйте стеклянную пипетку Pasteur, чтобы забрать иммобилизованные гермафродиты из часового стекла. Избегайте сосания гермафродитов за пределами узкой части пипетки. Перенесите гермафродиты на несеяную пластину NGM.
Удалите как можно больше жидкости и дайте лишней жидкости высохнуть. Как только вся видимая жидкость испарится, перенесите анестезированное гермафродиты на брачное поле с окрашенными самцами. Инкубировать в темноте в течение 30 минут, чтобы обеспечить спаривание.
При желаемой оценке распределения спермы перенесите спариваемые гермафродиты на семенную пластину NGM и дайте им отдохнуть в течение одного часа перед монтажом для визуализации. Чтобы смонтировать червей для визуализации, сначала капают от 10 до 15 микролитров раствора теттрамизола/трикаина на подготовленную подушечку 2%агарозы и передают спариваемые гермафродиты в раствор на площадке. Поместите крышку над червями.
Намонтировать слайд на вертикальном микроскопе оснащен эпифлюоресценции, и положение червя так, что как вульвы и одной сперматеки в поле зрения. Сосредоточьте изображение, сосредоточив внимание на центре сперматеки. Проверьте экспозицию как для каналов DIC, так и для TRITC.
В DIC хорошо видны внутренние структуры червей. В TRITC, отдельные сперматозоиды видны как различные puncta. Приобрети изображения DIC и флуоресценции для каждой матки.
Чтобы запечатлеть замедленное видео, сначала найдите гермафродиты, содержащие помеченную сперму в матке. На панели приобретения отрегулируйте интервалы получения изображения до 15-30 секунд, а продолжительность до 10-20 минут на матку. Затем нажмите Run, чтобы получить изображения замедленного действия в каналах DIC и TRITC.
Начиная с вульвы на одном конце и сперматозоидов на другом, разделить матку на три зоны, с зоной, содержащей вульвы и зоны три, содержащие сперматека. Вручную подсчитайте количество сперматозоидов в каждой трети матки и сообщите о количестве в каждой зоне в процентах от общей спермы во всей матке. При необходимости используйте таблицу осмотра, чтобы настроить интенсивность сигнала изображений канала TRITC, чтобы каждая сперма можно было видеть и количественно.
Для отслеживания спермы на изображениях замедленного действия используйте для анализа программное обеспечение Фиджи. Используйте функцию импорта bio-Formats для импорта изображений из одной серии промежуток времени в качестве одного гиперстаха. Затем щелкните плагины, отслеживая, а затем ручное отслеживание.
В открытой диалоговой коробке выберите инструмент TrackMate в панели инструментов Фиджи. Дважды нажмите на сперму, которая будет отслеживаться. Нажмите внутри появился зеленый круг с пунктирной линии, и перетащите в нужное положение.
Нажмите на круг еще раз. Разбитая зеленая линия превращается в сплошную зеленую линию. Одновременно включи клавиши Shift и L, чтобы включить режим отслеживания.
Переход к следующему кадру в серии промежуток времени. Чтобы установить новое местоположение отслеживаемой спермы в новом кадре, наведите мышь на новую точку и нажмите клавишу A. Трекер появляется на новом месте, и появляется строка, соединяющая место, где трекер был помещен в предыдущем кадре.
Повторите ту же процедуру для остальных кадров. После того, как следы будут завершены, нажмите Анализ в диалоговом поле TrackMate для генерации необходимых данных. Чтобы рассчитать скорость, разделите общую длину пути спермы по прошедшему времени.
Чтобы рассчитать векторную скорость, провести линию через матку, начиная с вульвы, указывая на spermatheca. Используйте инструмент Line для измерения расстояния, которое сперма мигрировала по этой линии от начала до конца трассировки. Разделите это расстояние по прошедшее время.
Отрицательные значения указывают на то, что сперма мигрировала из сперматеки. Чтобы зафиксировать частоту разворота, подсчитайте количество раз, в течение которых след спермы генерирует угол менее 90 градусов в течение трех последовательных временных рамок. В этом протоколе, туман-2 q71 самцов червей были окрашены мито-красителя и в спариваются с диким типом N2 гермафродитов.
Взрослый гермафродит репродуктивного тракта имеет две руки, которые являются зеркальными изображениями друг друга. После спаривания, помеченные сперматозоиды откладываются в матке гермафродита через вульву. Сперма движется вокруг развивающихся эмбрионов в матке, к сперматеке, где они хранятся до оплодотворения.
Матка гермафродита была разделена на три зоны для количественной оценки распределения спермы и миграции. Для оценки скорости спермы и частоты разворота, только сперма в зоне 2 были отслежены через замедленного изображения. Сперма в первой зоне, начиная с вульвы, и зона 3, включая сперматеку, как правило, перемещаются по круговой схеме.
Сперма, отмеченная красными и синими точками, имела количественную оценку скорости спермы и частоты разворота. При количественной оценке распределения спермы в матке, надлежащее руководство спермы с использованием диких типа N2 гермафродитов и туман-2 q71 мужчины привели к примерно 90% помечены спермы достижения сперматека. Данные не должны быть подсчитаны, если спаривание приводит к слишком мало спермы в матке или слишком много спермы в матке, заполняя каждую щель.
Важно, чтобы животные обращались мягко во время каждого шага передачи, что гермафродиты обездвижены полностью, и что пластины и черви, содержащие мио-краситель защищены от света. Этот метод может быть объединен с геном нокдаун или нокаут экспериментов, экологических или химических экспериментов воздействия, или другие манипуляции для выявления факторов, которые могут регулировать миграцию спермы. Этот метод позволил нам определить конкретные простагландины, которые имеют важное значение для направления спермы в яйцеклетку.
Эти простагландины синтезируются с помощью нетрадиционного механизма, который может быть сохранен у высших млекопитающих. Теттрамизол, трикаин, DMSO являются раздражающими для кожи и глаз и могут иметь токсическое воздействие в высоких дозах. Важно носить соответствующее защитное снаряжение при обращении с любыми химическими веществами.
