이 방법은 과학자가 여성 생식 기관 내의 그들의 토착 환경에서 정액 이주 및 행동에 영향을 미치는 환경 유전 요인을 연구하는 공구를 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 실험자가 살아있는 동물에서 정자 운동을 쉽게 시각화하고 기록 할 수있는 C.elegans의 투명한 표피에서 비롯됩니다. 먼저 한쪽 끝에 평평하게 된 파스퇴르 파이펫과 플래티넘 와이어로 만든 웜 픽을 사용하여 20~30L4 스테이지 헤르마프로디트를 선택하고 6센티미터 시드 NGM 플레이트에 부드럽게 놓습니다.
28~30시간 동안 20도에서 헤르마프로디나이트를 배양합니다. 다음으로, 남성 염색 판을 만듭니다. 씨앗 접시의 박테리아 잔디에서 E.coli를 긁어 유리 교반 막대의 끝을 사용하여, 5 ~ 7 밀리미터 직경의 식품 점을 만들기, 시드되지 않은 NGM 플레이트의 중앙에 그것을 입금.
DMSO에서 1밀리머 미토 염료 2개와 마이크로센심분리기 튜브에 M9 완충제 10마이크로리터를 섞는다. 피펫 모든 미토 염색 용액은 남성 염색 플레이트의 식품 점에. 접시를 어둠 속에서 30분 동안 건조시다.
현미경의 밑에, 1-3 일 된 성인 C.elegans를 포함하는 접시에, 그들의 팬 모양의 꼬리에 의해 남성을 식별합니다. 남성 염색 플레이트에 미토 염료 염색 식품 점에 약 100명의 수컷을 선택합니다. 접시를 알루미늄 호일로 감싸고 밤새 16도에서 배양합니다.
둘째 날, 스테인드 수컷을 새로운 시드 NGM 플레이트에 전달하여 과도한 미토 염료 염색 균을 제거합니다. 접시를 짝짓기 할 때까지 어둠 속에서 유지하십시오. 짝짓기 플레이트를 만들기 위해, 시드되지 않은 NGM 플레이트에, 두꺼운 대장균 혼합물의 두 마이크로 리터를 드립.
두꺼운 박테리아가 마르기까지 약 10~15분 정도 기다립니다. 짝짓기 플레이트가 마르기를 기다리는 동안 볼륨 트리사인에 의해 1 %의 300 마이크로 리터, 볼륨 테트라미솔에 의해 0.1 %의 마이크로 리터 300 마이크로 리터, M9의 900 마이크로 리터를 함께 섞는다. 테트라미솔/트리사인 용액 600마이크로리터를 시계 유리로 옮기. 시계 유리의 테트라미솔/트리카인 용액으로 첫날 에선정된 12~15개의 헤르마프로디트..
페트리 접시의 아래쪽 절반을 시계 유리 위에 놓고 증발을 막고 30분 동안 배양하여 헤르마플로디나이트를 고정시합니다. 다음으로, 어둠에서 염색 된 수컷을 포함하는 시드 NGM 플레이트를 검색하고 짝짓기 플레이트의 말린 짝짓기 점에 50 ~ 60 개의 염색 된 수컷을 선택합니다. 접시를 어둠 속에서 보관합니다.
헤르마프로디트가 고정된 후 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 시계 유리에서 고정된 헤르마프로디트를 집어들수 있습니다. 피펫의 좁은 부분을 넘어 헤르마프로디트를 빨아하지 마십시오. 헤르마로디테를 시드가 없는 NGM 플레이트로 옮기다.
가능한 한 많은 액체를 제거하고 여분의 액체를 건조시키십시오. 모든 눈에 보이는 액체가 증발하자마자 마취된 헤르마프로디타이트를 스테인드 수컷과 짝짓기 점으로 옮기습니다. 짝짓기를 허용하기 위해 어둠 속에서 30 분 동안 배양하십시오.
정자 분포 평가가 바람직한 경우, 메이트 된 헤르마로디테를 시드 NGM 플레이트로 옮기고 시각화를 위해 장착하기 전에 1 시간 동안 휴식을 취할 수 있습니다. 시각화를 위해 벌레를 장착하려면 먼저 테트라미솔/트리사인 용액의 10~15마이크로리터를 준비된 2% 아가로즈 패드에 드립시키고, 메이트된 헤르마프로디테를 패드의 용액으로 옮킨다. 벌레 위에 덮개 슬립을 놓습니다.
슬라이드를 상피 불피성 으로 장착 된 직립 현미경에 장착 한 직립 현미경에 마운트하고 외음부와 정자 1 개를 모두 볼 수 있도록 웜을 배치합니다. 정자의 중심에 초점을 맞추어 이미지에 초점을 맞춥니다. DIC 및 TRITC 채널 모두에 대한 노출을 확인합니다.
DIC에서 내부 웜 구조가 명확하게 표시됩니다. TRITC에서, 개별 적인 정액은 뚜렷한 말장난으로 보입니다. 각 자궁에 대한 DIC 및 형광 이미지를 획득하십시오.
시간 경과 비디오를 캡처하려면 먼저 자궁 내에서 표지 된 정자가 포함 된 hermaphrodites를 찾습니다. 획득 패널에서 이미지 획득 간격을 15~30초로 조정하고 자궁당 지속 시간을 10~20분으로 조정합니다. 그런 다음 실행을 클릭하여 DIC 및 TRITC 채널에서 시간 경과 이미지를 수집합니다.
한쪽 끝에 있는 외음부와 다른 쪽의 정자를 시작으로 자궁을 세 개의 영역으로 나누고, 외음부와 정자를 포함하는 영역 3개가 포함되어 있습니다. 자궁의 각 3분의 1 내의 정자 수를 수동으로 계산하고, 각 구역의 수를 전체 자궁에 있는 총 정자의 백분율로 보고합니다. 필요한 경우 조회 테이블을 사용하여 TRITC 채널 이미지의 신호 강도를 조정하여 모든 정자를 표시하고 정량화할 수 있도록 합니다.
시간 경과 이미지에서 정자를 추적하려면 분석을 위해 피지 소프트웨어를 사용합니다. Bio-Formats 가져오기 함수를 사용하여 한 타임랩스 계열에서 이미지를 하나의 하이퍼스택으로 가져옵니다. 그런 다음 플러그인, 추적 및 수동 추적을 클릭합니다.
열린 대화 상자에서 피지 도구 모음에서 TrackMate 도구를 선택합니다. 추적될 정자를 두 번 클릭합니다. 파선으로 나타난 녹색 원 내부를 클릭하고 원하는 위치로 드래그합니다.
원을 다시 클릭합니다. 파선된 녹색 선은 단단한 녹색 선으로 바뀝니다. 동시에 Shift 및 L 키를 누르고 추적 모드를 켭니다.
타임랩스 시리즈의 다음 프레임으로 이동합니다. 새 프레임에서 추적된 정자의 새 위치를 설정하려면 마우스를 새 점 위로 마우스를 마우스로 가져가서 A 키를 누릅니다. 트래커가 새 위치에 나타나고 선이 나타나트래커가 이전 프레임에 배치된 위치를 연결합니다.
프레임의 나머지 부분에 대해 동일한 절차를 반복합니다. 추적이 완료된 후 TrackMate 대화 상자에서 분석을 클릭하여 필요한 데이터를 생성합니다. 속도를 계산하려면 정자의 총 경로 길이를 경과 된 시간으로 나눕니다.
벡터 속도를 계산하려면 외음부에서 시작하여 정자를 가리키며 자궁을 통해 선을 그립니다. 선 도구를 사용하여 정자가 추적의 시작부분에서 끝까지 이 줄을 따라 마이그레이션한 거리를 측정합니다. 이 거리를 경과된 시간으로 나눕니다.
부정적인 값은 정자가 정자에서 멀리 이동했음을 나타냅니다. 반전 빈도를 기록하려면 정자 추적이 3회 연속 경과 프레임 동안 90도 미만의 각도를 생성한 횟수를 계산합니다. 이 프로토콜에서, 안개-2 q71 남성 벌레는 미토 염료로 염색하고 야생 형 N2 헤르마프로디테에 결합되었다.
성인 hermaphrodite 생식 관은 서로의 거울 이미지 두 개의 팔을 가지고있다. 짝짓기 시, 표지된 정자는 외음부를 통해 헤르마프로디테 자궁에 증착됩니다. 정자는 자궁 내의 발전 하는 배아 주위 이동, 정자를 향해, 어디 그들은 수정 될 때까지 저장 됩니다.
헤르마프로디테 자궁은 정자 분포와 이주를 정량화하기 위한 세 개의 영역으로 나뉘었다. 정자 속도 및 반전 주파수를 평가하기 위해, 영역 2의 정자만 시간 경과 이미지를 통해 추적되었습니다. 외음부에서 시작하여 구역 1의 정자와 정자를 포함한 3 개의 구역은 원형 패턴으로 이동하는 경향이 있습니다.
빨간색과 파란색 점으로 표시된 정자는 정자 속도와 반전 주파수를 정량화했습니다. 자궁에서 정자 분포를 정량화할 때, 야생형 N2 헤르마프로다이트와 안개-2 q71 남성을 이용한 적절한 정자 지침은 표지된 정자의 약 90%가 정자에 도달하는 결과를 낳았다. 짝짓기는 자궁에 있는 너무 적은 정액 또는 자궁에 있는 너무 많은 정액결과, 각 틈새를 채우는 경우에 계산해서는 안됩니다.
동물은 각 전송 단계 동안 부드럽게 처리되는 것이 중요합니다, 헤르마프로디트 완전히 고정되고, 심모 염료를 포함하는 접시와 벌레는 빛으로부터 보호된다. 이 방법은 정자 이동을 조절할 수 있는 요인을 확인하기 위해 유전자 녹다운 또는 녹아웃 실험, 환경 또는 화학 적 노출 실험 또는 기타 조작과 결합될 수 있습니다. 이 기술은 우리가 난모세포에 정액을 지도하기 위한 중요한 특정 prostaglandins를 확인하는 것을 가능하게 했습니다.
이러한 프로스타글란딘은 더 높은 포유류에서 보존될 수 있는 틀에 얽매이지 않는 메커니즘을 통해 합성됩니다. 테트라미솔, 트리카인, DMSO는 피부와 눈 자극제이며 고용량에서 독성 효과가있을 수 있습니다. 화학물질을 취급할 때 적절한 보호 장비를 착용하는 것이 중요합니다.
