Mesure du sperme guidage et motilité dans le Caenorhabditis elegans hermaphrodite appareil de reproduction

Cette méthode fournit aux scientifiques un outil pour étudier les facteurs génétiques environnementaux qui affectent la migration et le comportement des spermatozoïdes dans leur environnement natal à l’intérieur de l’appareil reproducteur féminin. Le principal avantage de cette technique provient de l’épiderme transparent du C.elegans, qui permet aux expérimentateurs de visualiser et d’enregistrer facilement le mouvement du sperme chez les animaux vivants. Pour commencer, utilisez un pic de ver fabriqué à partir d’une pipette Pasteur et d’un fil de platine aplati à une extrémité pour cueillir des hermaphrodites de 20 à 30 stades L4, et placez-les délicatement sur une plaque NGM ensemencée de six centimètres.

Incuber les hermaphrodites à 20 degrés Celsius pendant 28 à 30 heures. Ensuite, faites une plaque de coloration masculine. Utilisez l’extrémité d’une tige en verre pour gratter E.coli de la pelouse bactérienne d’une plaque ensemencée, et déposez-la au centre d’une plaque de NGM non ensemencée, ce qui fait un point alimentaire de cinq à sept millimètres de diamètre.

Mélanger deux microlitres de mito-colorant d’un millimolaire dans le DMSO et 10 microlitres de tampon M9 dans un tube de microcentrifugeuse. Pipette toute la solution mito-colorant sur le point de nourriture sur l’assiette de coloration masculine. Placer la plaque dans l’obscurité pour la sécher pendant 30 minutes.

Au microscope, sur une plaque contenant des C.elegans adultes d’un à trois jours, identifiez les mâles par leur queue en forme de ventilateur. Choisissez environ 100 mâles au point d’aliments teintés de mito-teinture sur l’assiette de coloration masculine. Envelopper la plaque dans du papier d’aluminium et incuber toute la nuit à 16 degrés Celsius.

Le deuxième jour, transférez les mâles tachés sur une nouvelle plaque NGM ensemencée pour nettoyer l’excès de bactéries teintées de mito-teinture. Gardez la plaque dans l’obscurité jusqu’à l’accouplement. Pour faire une plaque d’accouplement, sur une plaque NGM non enseillée, égoutter deux microlitres d’épais mélange e.coli.

Attendez environ 10 à 15 minutes que les bactéries épaisses sèchent pour former un point d’accouplement. En attendant que la plaque d’accouplement sèche, mélanger 300 microlitres de 1% de poids en volume tricaine, 300 microlitres de 0,1% de poids par tétramisole de volume, et 900 microlitres de M9. Transférer 600 microlitres de la solution tétramisole/tricaine dans un verre de montre. Transférer 12 à 15 hermaphrodites cueillies le premier jour dans la solution tétramisole/tricaine sur le verre de la montre.

Placer la moitié inférieure d’une boîte de Pétri sur le verre de la montre pour la garder couverte d’évaporation, et incuber pendant 30 minutes pour immobiliser les hermaphrodites. Ensuite, récupérez la plaque NGM ensemencée qui contient les mâles tachés de l’obscurité, et cueillez 50 à 60 mâles tachés sur le point d’accouplement séché sur la plaque d’accouplement. Rangez l’assiette dans le noir.

Une fois les hermaphrodites immobilisées, utilisez une pipette Pasteur en verre pour ramasser les hermaphrodites immobilisées dans le verre de la montre. Évitez de sucer les hermaphrodites au-delà de la partie étroite de la pipette. Transférer les hermaphrodites sur une plaque NGM non enseillée.

Retirer le plus de liquide possible et laisser sécher l’excès de liquide. Dès que tout le liquide visible s’est évaporé, transférez les hermaphrodites anesthésiés sur le point d’accouplement avec les mâles tachés. Incuber dans l’obscurité pendant 30 minutes pour permettre l’accouplement.

Si l’évaluation de la distribution du sperme est souhaitée, transférez les hermaphrodites aérés dans une plaque NGM ensemencée et laissez-les reposer pendant une heure avant de monter pour la visualisation. Pour monter des vers pour la visualisation, égouttez d’abord 10 à 15 microlitres de la solution tétramisole/tricaine sur la garniture préparée d’agarose de 2%, et transférez les hermaphrodites ac acérés dans la solution sur le pad. Placez un coverslip sur les vers.

Montez la lame sur un microscope droit équipé d’épifluorescence, et placez le ver de sorte que la vulve et un spermatheca soient en vue. Concentrez l’image en vous concentrant sur le centre du spermatheca. Vérifiez l’exposition des canaux DIC et TRITC.

Dans DIC, les structures internes de ver sont clairement visibles. Dans tritc, le sperme individuel sont visibles comme ponction distincte. Acquérir des images de DIC et de fluorescence pour chaque utérus.

Pour capturer des vidéos en accéléré, localisez d’abord les hermaphrodites qui contiennent du sperme étiqueté dans l’utérus. Sur le panneau d’acquisition, ajuster l’image acquérir des intervalles à 15 à 30 secondes et la durée à 10 à 20 minutes par utérus. Ensuite, cliquez sur Exécuter pour acquérir des images time-lapse dans les canaux DIC et TRITC.

En commençant par la vulve d’un côté et le spermatheca de l’autre, divisez l’utérus en trois zones, avec une zone contenant la vulve et la zone trois contenant le spermatheca. Comptez manuellement le nombre de spermatozoïdes dans chaque tiers de l’utérus, et signalez le nombre dans chaque zone comme un pour cent du sperme total dans l’utérus entier. Si nécessaire, utilisez la table de recherchez pour ajuster l’intensité du signal des images du canal TRITC afin que chaque spermatozoïde puisse être visible et quantifié.

Pour suivre le sperme dans les images en accéléré, utilisez le logiciel Fidji pour l’analyse. Utilisez la fonction Bio-Formats Import pour importer les images d’une série time-lapse comme une hyperstack. Ensuite, cliquez sur Plugins, Tracking, puis Manual Tracking.

Dans la boîte de dialogue ouverte, sélectionnez l’outil TrackMate dans la barre d’outils Fidji. Double-cliquez sur le sperme qui sera suivi. Cliquez à l’intérieur du cercle vert apparu avec des lignes pointillées, et faites glisser vers la position désirée.

Cliquez à nouveau sur le cercle. La ligne verte pointillée se transforme en une ligne verte solide. Frappez simultanément les touches Shift et L pour activer le mode de suivi.

Passez au cadre suivant de la série time-lapse. Pour définir le nouvel emplacement du sperme suivi dans le nouveau cadre, faites planer la souris au-dessus du nouveau point et appuyez sur la touche A. Le traqueur apparaît au nouvel emplacement, et une ligne apparaît, reliant l’emplacement où le traqueur a été placé dans le cadre précédent.

Répétez la même procédure pour le reste des cadres. Une fois les traces terminées, cliquez sur Analyser dans la boîte de dialogue TrackMate pour générer les données nécessaires. Pour calculer la vitesse, divisez la longueur totale du chemin du sperme par le temps écoulé.

Pour calculer la vitesse vectorielle, tracez une ligne à travers l’utérus à partir de la vulve, pointant vers le spermatheca. Utilisez l’outil Ligne pour mesurer la distance que le sperme a migrée le long de cette ligne du début à la fin de la trace. Divisez cette distance par le temps écoulé.

Les valeurs négatives indiquent que le sperme a migré loin du spermatheca. Pour enregistrer la fréquence d’inversion, comptez le nombre de fois au cours duquel la trace de sperme a généré un angle inférieur à 90 degrés pendant trois laps de temps consécutifs. Dans ce protocole, les vers mâles fog-2 q71 ont été tachés de mito-colorant et se sont attelés à des hermaphrodites N2 de type sauvage.

L’appareil reproducteur hermaphrodite adulte a deux bras qui sont des images miroir de l’autre. Lors de l’accouplement, les spermatozoïdes étiquetés sont déposés dans l’utérus hermaphrodite à travers la vulve. Le sperme se déplace autour des embryons en développement dans l’utérus, vers le spermatheca, où ils sont stockés jusqu’à la fécondation.

L’utérus hermaphrodite a été divisé en trois zones pour quantifier la distribution et la migration du sperme. Pour évaluer la vitesse du sperme et la fréquence d’inversion, seuls les spermatozoïdes de la zone deux ont été suivis à l’moyen d’images en accéléré. Les spermatozoïdes de la première zone, à partir de la vulve, et la zone trois, y compris le spermatheca, ont tendance à se déplacer dans un modèle circulaire.

Le sperme marqué par les points rouges et bleus a eu la vitesse de sperme et la fréquence d’inversion quantifiées. Lors de la quantification de la distribution du sperme dans l’utérus, une bonne orientation du sperme à l’aide d’hermaphrodites N2 de type sauvage et de brouillard-2 q71 mâles a entraîné environ 90% du sperme étiqueté atteignant le spermatheca. Les données ne doivent pas être comptées si l’accouplement entraîne trop peu de spermatozoïdes dans l’utérus ou trop de sperme dans l’utérus, remplissant chaque crevasse.

Il est important que les animaux soient manipulés en douceur à chaque étape de transfert, que les hermaphrodites soient complètement immobilisés et que les plaques et les vers contenant le myo-colorant soient protégés de la lumière. Cette méthode peut être combinée avec des expériences de knockdown génétique ou knock-out, des expériences d’exposition environnementale ou chimique, ou d’autres manipulations pour identifier les facteurs qui peuvent réguler la migration des spermatozoïdes. Cette technique nous a permis d’identifier des prostaglandines spécifiques qui sont importantes pour guider le sperme vers l’ovocyte.

Ces prostaglandines sont synthétisées par un mécanisme non conventionnel qui peut être conservé chez les mammifères supérieurs. Tétramisole, tricaine, DMSO sont irritants pour la peau et les yeux et peuvent avoir des effets toxiques à fortes doses. Il est important de porter l’équipement de protection approprié lors de la manipulation de produits chimiques.