该协议意义重大，因为它可用于询问人类捐赠者的免疫功能，以识别罕见的抗原特异性B细胞。这种技术使我们能够获得本地配对的重链和轻链，可以快速克隆，然后直接测试对抗原或抗原的兴趣。演示这个程序的将是迈克莫顿，一个技术员从我们的实验室。
解冻和恢复后至少一小时，通过离心收集供体PBMC。并重新悬浮在50毫升的冰冷的 MES 缓冲液中的细胞计数。通过另一个离心机将细胞分离，然后根据标准协议使用CD22微珠通过正选择分离CD22阳性B细胞。
通过离心收集珠分离的CD22阳性细胞，并在每毫升Vax缓冲液浓度的四倍10至第七细胞中重新填充细胞。根据制造商的稀释建议，将IgG CD19 CD27抗体鸡尾酒加入细胞中，轻轻混合，将10等分到第七细胞中，放入1.5毫升微离心管中，进行阴性控制。将双标记生物素步进蛋白三酰安培添加到负控制管中，最终浓度为 36 纳米摩尔，每个浓度为 PE 和 APC，乘以分管中的肽数量。
将每个管中的最终体积 2.5 毫升与新鲜的 Vax 缓冲液一起加入，并将肽三角剂以 36 纳米摩尔（每个 PE 和 APC）添加到管中。离心后，将细胞达到每100微升TBS浓度的2倍10至6，在黑暗中，在4摄氏度的温度下，进行30至60分钟的孵育，旋转。在孵育结束时，每次洗涤时用新鲜 TBS 缓冲液清洗细胞两次，然后将样品放入单独的五毫升滤波管中。
将样品与DAPI的最终浓度为0.3微摩尔，作为细胞膜完整性的标记。并在细胞分拣机上运行整个负控制，以设置流式细胞学门，用于隔离用于单细胞分拣的适当细胞群。绘制抗原 PE 与抗原 APC，将 R8 门设置为抗原 PE 阳性，将 APC 阳性象限设置为双正门中的事件数较低。
然后，将单一的CD19阳性CD27阳性抗原PE阳性，抗原PCC阳性细胞分拣到主混合准备的96孔板的单个孔中。在该排序结束时，用铝胶带垫盖住板，并在负 80 度储存前以 400 倍 g 离心 400 倍的电池。要执行逆转录酶反应，在冰上解冻分拣的B细胞两分钟，然后旋转板2分钟，在3300倍g下将井内板拉到板底，然后打开。
使用适当的酶 Master Mix 处理细胞后，添加 2.5 微升的免费 DNA 作为每个 PCR 反应的模板，并将底向剂添加到每个反应的最终浓度 1 微摩尔中。然后，在每一个井中加入2X浓度10倍的聚合酶缓冲液，使最终体积达到每次反应25微升。运行重链和轻链PCR反应，每个50个周期。
在反应结束时，在1%的加糖凝胶上运行样品，以可视化正放大命中。通过凝胶提取，从同一细胞中分离成对重链和轻链反应。确定DNA片段浓度由光学密度到60，以进行精确的结扎混合计算。
根据制造商的说明，使用四个片段结扎反应，将回收的重链和轻链片段与链接器片段和表达向量骨干相结合。根据制造商的说明，将结扎反应转化为化学能力细菌。一旦镀在抗生素盘上，加入四毫升的生长介质与抗生素到剩余的转化培养，在37摄氏度下以每分钟250次旋转孵育过夜。
第二天早上，根据制造商的说明，从隔夜结扎混合培养物中准备一个迷你DNA，并确定由此产生的质粒DNA浓度。为了确认分离抗体的抗原特异性，转染10微克的微精脱氧核糖核酸与阳离子脂基试剂在293个细胞的10毫升悬浮液中。在37摄氏度和8%的二氧化碳和每分钟125次旋转下孵育细胞培养三到四天。
在孵育结束时，以1000倍g离心培养10分钟，并恢复澄清的培养。通过与蛋白质 A 的亲和力测量上清液中的 IgG 浓度，并测试上清液中每毫升浓度为 25 微克的 ELISA 对照根据标准 ELISA 协议用于该种的单个肽的每种抗体。然后，使用 IgG 上经剂的稀释来确认屏幕正击，以产生从每毫升 20 微升开始的浓度曲线，并针对显示对初始屏幕 ELISA 的活性的每个抗原的光学密度绘制。
为了从人类捐赠者中分离抗原特异性抗体，可以设计出一系列细胞学门来分离目标记忆B细胞。淋巴细胞根据细胞大小和粒度进行分离，使用正向和侧散射。在排除双细胞和死细胞后，表型标记允许分离IgG阳性CD19阳性B细胞和CD27阳性记忆B细胞。
单细胞克隆的第一次读出是确认各自的重和轻可变链的放大。这里，一个在PCR后具有42%配对恢复的24个单细胞的高效扩增示例。在IgG克隆之后，IgG表达载体被移植到人类胚胎肾293个细胞中。
回收的抗体根据由ELISA为反应性评分的Tau肽的原始面板进行筛选。然后，使用相同重组抗体样本的浓度曲线对初始屏幕中识别的肽完成额外的确认。对于每次阳性命中，单个质粒克隆可以从转换的池中分离，并使用相同的 ELISA 方法重新确认。
目标是从单个细胞放大序列，所以最重要的是要记住的是，任何污染将被放大在PCR部分的过程。此过程可产生完整的人类重组抗体，从而能够纯化和功能性表征尽可能多的抗体，如您希望生成。
