血浆细胞是罕见的细胞，在解剖位置发生30个分化阶段，损害完整的生物特征，特别是在人类。我们的体外B2血浆细胞分化模型再现了体内不同器官中发生的连续细胞分化和成熟。此体外模型回顾了在体内可以检测到的不同 B2 血浆细胞阶段的协调转录变化和表型。
我们还构建了一个开放访问生物信息工具，用于分析与等离子细胞分化相关的勘探数据中最突出的信息。演示程序将是胡格斯德布萨克，一个博士后从我的实验室。首先，从健康志愿者获得外周血细胞，用于记忆B细胞纯化。
用 24.5 毫升的 RPMI 1640 介质稀释 7.5 毫升血液。接下来，将12.5毫升室温密度梯度添加到无菌的50毫升锥形管中。轻轻覆盖密度梯度与32毫升稀释的血液，确保尽量减少两个阶段的混合。
在制动器关闭时，在 500 倍重力下离心 20 分钟。从稀释的血浆和密度梯度界面收集外周血单核细胞。将细胞转移到无菌的50毫升管中，用汉克的平衡盐溶液填充高达45毫升的管子。
在500倍重力下离心5分钟。小心地取出上一液，并保留颗粒。然后，加入45毫升的RPMI 1640介质，辅以10%FCS。
在500倍重力下离心5分钟。小心地取出上一液，并保留颗粒。加入30毫升PBS，辅以2%FCS。
使用防CD磁珠去除CD2阳性细胞，为一个目标细胞添加四个磁珠。在4摄氏度下孵育30分钟。使用磁铁进行细胞分离应用，将珠状细胞与未绑定的细胞分离。
收集未结合的细胞，用抗CD19 APC和抗CD27PE抗体孵育，在4摄氏度下孵育15分钟。在含有10%山羊血清的PBS中清洗细胞两次。然后，使用细胞分拣机将记忆B细胞净化到95%的纯度。
在此之后，加入可溶性CD40配体和抗多石丁单克隆抗体，用于记忆B细胞激活。用白细胞间-2、白细胞-10和白细胞-15将纯化记忆B细胞在六孔培养板中镀4天。对于基因表达分析，使用细胞分拣机在第四天纯化CD38阴性CD20阴性前细胞。
在第四天，通过向每孔添加两毫升细胞悬浮液，计算细胞数，并在每毫升25万个细胞密度的细胞密度的12孔培养板中镀入细胞。为了诱导分化，去除CPG寡核苷酸和可溶性CD40配体，并添加含有新的细胞因子鸡尾酒的培养基，包括白细胞素-2、白细胞素-6、白细胞素-10和白细胞素-15。在37摄氏度下培养细胞三天。
对于基因表达分析，使用细胞分拣机在第七天纯化CD38阳性、CD20阴性血浆细胞。第七天，数一数细胞。通过向每孔添加两毫升细胞悬浮液，将12孔培养板中的细胞以每孔50万个细胞密度进行镀。
使用含有白细胞间素-6、白细胞-15和干扰素-α的新鲜培养基将血浆细胞分化成早期血浆细胞，在37摄氏度下连续三天。对于基因表达分析，使用细胞分拣机在第10天纯化CD20阴性、CD38阳性、CD138-阳性的早期血浆细胞。首先，培养细胞用培养媒介五天。
使用 0.2 微升过滤器过滤频闪细胞培养上清液，以获得频闪细胞条件介质并冻结，直到准备好使用。接下来，培养12孔培养板中的早期血浆细胞，使用先前获得的白细胞间-6和S四月（APRIL）的频闪细胞培养基，每孔细胞密度为50万细胞，向每孔添加两毫升细胞悬浮液。在37摄氏度下孵育，每周更新频闪细胞条件介质。
然后，测量流细胞分类的血浆细胞中的免疫球蛋白分泌。以每毫升一百万个细胞的密度培养血浆细胞24小时，收获培养上一升。使用ELISA试剂盒，测量免疫球蛋白G和免疫球蛋白A.第一，启动基因组Scape开放访问生物信息学网络工具。
在浏览数据菜单中，选择名为"人类 B 细胞"的数据集到血浆单元。使用分析工具中的表达/表达报告工具，可对独特基因或基因列表的基因表达配置文件进行可视化。接下来，选择分析工具 webSAM 以加载 SAM 工具。
选择人类B细胞到血浆细胞数据集，并选择要比较的样本组。使用不同的筛选器来应用感兴趣的筛选选项。要将基因表达配置文件与 SAM 工具进行比较，请修改筛选选项，包括折叠更改、排列数、错误发现率和比较类型。
该软件将计算分析，并提供所选组之间的不同表达的基因。本研究对正常血浆细胞分化中表观遗传因子的表达变化进行了调查。使用多类 SAM 分析，71 个基因在记忆 B 细胞之间明显有差异地表达， 前脑细胞、血浆细胞、早期血浆细胞和假发现率低于5%的骨髓血浆细胞记忆B细胞阶段的特点是23个表观遗传播放器基因过度表达，包括39.13%的组蛋白乙酰转移酶，30.43%的组蛋白甲基代转酶，21.74%的组蛋白脱脂酶，4.35%的甲基结合蛋白，4.35%的组蛋白去乙酰酶。
14个表观遗传播放器基因在前细胞阶段被显著过度表达，包括50%的组蛋白甲基转移酶，14.28%的DNA甲基转移酶，21.43%的组蛋白去乙酰胺，7.14%的组蛋白解乙酰酶，和17.14%的组蛋白丙酰转移酶。按照此过程，可以进行多项分析，以识别和了解在这些 B2 等离子细胞分化期间染色质结构和结构的修改。这种体外分化模型将允许生成足够的细胞来完成这一分子分析，以揭示整个建模所涉及的通路及其在B2血浆细胞分化期间的下游转录影响。
从这项研究中获得的这些知识可以指导和指导血浆细胞疾病的诊断和治疗策略，例如多发性骨髓瘤，一种没有明确治愈的癌症，为此迫切需要更好的预后和改进的治疗策略。在B2等离子细胞分化期间，描述和理解影响染色质的表观遗传重塑结构和结构变化将特别令人感兴趣。这可以通过基因测序、ERRBS、ATAC测序、IC和RNA测序完成。
根据健康供体的血液，在用于记忆B细胞纯化的活性B细胞、前细胞、血浆细胞和血浆细胞的百分比中可以观察到中度异质性。
