该协议是重要的，因为它允许我们可视化的微环境，其中细胞产生给定的细胞因子，在这里，干扰素伽马。人们承认，细胞因子的行动范围是有限的，因为组织是如此复杂。重要的是要描述周围干扰素伽马产生细胞的细胞，以确定哪些细胞将占用它。
该技术的主要优点是，它不会破坏感兴趣的组织中的微环境。此外，由于我们不人工重新测量细胞以迫使它们产生干扰素伽马，它使我们更好地描述细胞是否实际在原位上积极产生干扰素伽马。该协议可能适用于其他器官和其他细胞因子的可视化。
该协议中的大多数步骤都很简单，但组织处理、冷冻和切块应小心执行，以保持组织的完整性。首先，将300微升的LM培养的转基因表达OVA到37摄氏度的烧瓶中向肉汤心脏输液。将烧瓶放在摇床上，轻轻搅拌，将 LM 长到指数相，直到 OD600 达到 0.08 至 0.1。
在PBS中的LM OVA培养物稀释至致命剂量0.1倍后，50%使用29量胰岛素注射器静脉注射100微升到C57黑色6野生型小鼠体内，接受OT1 GFP或OT1 RFP细胞。要在小鼠牺牲前6小时阻断细胞因子分泌，使用29量胰岛素注射器将250微克的BFA和200微升PBS注射。使用二氧化碳和随后的宫颈脱位对小鼠实施安乐死后，用70%乙醇清洗腹部。
在脾脏位于的小鼠的左侧，用剪刀切开皮肤，切开一到两厘米的切口。然后，小心地在内膜上切开一个切口，露出脾脏，然后用钳子把它拿出来。小心不要用钳子挤压它或切割它，以避免破坏脾脏结构。
现在，通过混合 3.75 毫升 PBS 和 3.75 毫升 0.2 摩尔 L-lysine 来准备固定溶液。加入21毫克的m-周期钠，混合良好。然后加入2.5毫升4%PFA和20微升12个正常氢氧化钠。
将脾脏切成三部分。将脾脏淹没在固定板中，并固定至少四个小时。典型的固定期是16至20小时，在4摄氏度的温和搅拌下。
之后，丢弃固定溶液，在温和的搅拌下，在室温下加入五毫升PBS5分钟。然后，用5毫升30%蔗糖代替PBS，孵育12至24小时，以保持组织形态。现在，器官在盘子底部下沉。
要冷冻样品，请将干冰放入大型贮器中，并在内放入一个较小的贮器，内含约50毫升纯甲醇和几块干冰。在无绒擦拭上轻轻擦干脾脏。在基模底部滴一滴 OCT 化合物，将脾脏放在模具内。
小心不要产生任何气泡。在脾脏上加入大约一毫升的 OCT。使用钳子，将基模沉积在干冰浴中的甲醇表面，确保甲醇不会接触 OCT。
OCT 会变厚，冷冻时变白。请记住尽快冻结组织，以尽量减少伪影。在低温微原子上，设置为零下20摄氏度的温度。
将组织分到所需的厚度，约10微米。使用刷子将部分收集到玻璃显微镜幻灯片上，并进行目视检查。让部分达到室温。
用液体阻滞器（例如，PAP 笔）在 OCT 外的组织部分周围绘制一个圆圈。组织干燥后，在组织部分滴100微升PBS，使样品重新补充水分5分钟。然后，通过吸气从部分中去除 PBS，并每个样品部分添加 100 微升的阻塞溶液。
在有盖的湿室中孵育，在室温下至少孵育一小时。要用原抗体染色，请用每个样品的制备原抗体混合物替换阻断溶液。在室温下孵育四小时，或在四摄氏度的覆盖湿室中孵育，然后根据手稿进行清洗。
现在，稀释感兴趣的二级抗体到最佳浓度，通常每毫升2.5微克，在阻断溶液。从该部分取出最终洗涤液，在部分顶部添加准备好的二次抗体混合物，并在室温下在覆盖的湿室中孵育一至四个小时。根据手稿用洗涤缓冲液清洗后，取出洗涤液，使用 PBS 进行最后洗涤。
吸气磷酸盐缓冲的盐水，让剩余的PBS蒸发，而不会完全干涸。在幻灯片背面的截面周围画一个圆圈。然后，将一滴安装介质放在样品顶部，确保介质覆盖整个部分，并小心地将盖玻璃放在顶部。
让样品在黑暗中室温下过夜聚合酶。早晨，将幻灯片放在倒置的光谱激光扫描显微镜下。调整目标为 10x NA 0.40 或 60x NA 1.4，用于分析细胞因子亚细胞定位。
在此协议中，产生干扰素伽马的细胞被可视化和定位。标记 F4/80 标记所有巨噬细胞并突出显示红色纸浆。标记 B220 标记 B 细胞并突出显示围绕 T 细胞区域的 B 细胞卵泡。
标记 CD169 标记白色纸浆周围的边缘区域巨噬细胞。感染后24小时，干扰素伽马由多个细胞产生，包括激活的抗原特异性OT1 CD8 T细胞和NK细胞。如果不利用BFA抑制细胞因子分泌，NK细胞对干扰素伽马的检测受到很大损害。
B细胞、边缘区巨噬细胞和所有巨噬细胞被染色，以描绘LM OVA感染后干扰素伽马产生细胞的位置。有趣的是，在脾脏的白浆中，发现聚类抗原特异性T细胞，但它们只在NK细胞与它们共存的区域产生干扰素伽马。显示了干扰素伽马和NK与CD8阳性T细胞的不同亚细胞定位。
当NK细胞中的干扰素伽马定位在细胞胶中扩散时，CD8阳性T细胞经常将干扰素伽马细胞移植到另一个T细胞。注射布雷费尔丁 A 是检测细胞因子原位的关键。细胞往往迅速分泌并接受细胞因子，我们需要抑制细胞因子分泌，让它在细胞中积累。
此方法是一种发现工具，用于将细胞因子生成细胞的原生环境中的细胞。破译此环境的组成使我们能够专注于在此位置存在、可能影响或受干扰素伽马影响的正确的细胞或免疫中介。人们越来越认识到，细胞在组织中的精确定位对于其功能至关重要。
我们的协议使我们能够识别细胞因子产生细胞的定位，从而进一步描述其功能。
