이 프로토콜은 세포가 주어진 사이토카인을 생성하는 마이크로 환경을 시각화 할 수 있기 때문에 중요합니다. 조직이 너무 복잡하기 때문에 사이토카인의 행동 범위가 제한적이라는 것은 인정됩니다. 인터페론 감마 생성 세포를 둘러싸고 있는 세포를 특성화하여 어떤 세포가 이를 복용할지 정확히 파악하는 것이 중요합니다.
이 기술의 주요 장점은 관심 있는 조직에 존재하는 미세 환경을 방해하지 않는다는 것입니다. 또한, 우리는 인위적으로 인터페론 감마를 생산하도록 세포를 자극하지 않기 때문에, 세포가 실제로 적극적으로 시투에서 인터페론 감마를 생산하고 있는지 여부의 더 나은 특성을 제공합니다. 이 프로토콜은 잠재적으로 다른 장기와 다른 사이토카인의 시각화에 적응할 수 있습니다.
이 프로토콜의 대부분의 단계는 간단하지만 조직의 처리, 동결 및 단면은 조직의 무결성을 보존하기 위해 주의하여 수행해야합니다. 시작하려면, LM의 300 마이크로 리터를 유전자 변형하여 소분으로 변형하여 플라스크에서 섭씨 37도의 국물 심장 주입에 대한 유전자 변형을 전달합니다. OD600이 0.08에서 0.1에 도달할 때까지 LM을 기하급수적으로 성장시키기 위해 부드러운 동요를 위해 셰이커에 플라스크를 놓습니다.
PBS에서 LM OVA 배양을 0.1배의 치명적인 용량으로 희석한 후, 50%는 29게이지 인슐린 주사기를 사용하여 C57 블랙 6 야생형 마우스 수신자에게 OT1 GFP 또는 OT1 RFP 세포를 베어링하여 정맥내 로 100마이크로리터를 주입한다. 마우스 희생 6시간 전에 사이토카인 분비를 차단하려면 250마이크로그램의 BFA와 200마이크로리터의 PBS 를 29게이지 인슐린 주사기로 주입한다. 이산화탄소와 후속 자궁 경부 탈구를 사용하여 마우스의 안락사 후, 70 %에탄올로 복부를 정화합니다.
비장이 있는 마우스의 왼쪽 측면에 가위로 피부를 잘라 1~2센티미터의 절개를 합니다. 그런 다음, 조심스럽게 비장을 노출하고 핀셋으로 꺼내 기 위해 회대에서 절개를합니다. 비장 아키텍처를 방해하지 않도록 집게로 짜내거나 잘라내지 않도록 주의하십시오.
이제 PBS 3.75 밀리리터와 0.75 밀리리터0.2 어금니 L-리신을 혼합하여 고정 솔루션을 준비합니다. 나트륨 m-치수 21 밀리그램을 넣고 잘 섞습니다. 그런 다음 4%의 PFA와 12개의 일반 수산화나트륨의 20마이크로리터를 2.5밀리리터를 추가합니다.
비장을 세 부분으로 자른다. 6웰 플레이트에 고정된 비장을 잠그고 최소 4시간 동안 수정합니다. 일반적인 고정 기간은 완만한 동요하에서 섭씨 4도에서 16~20시간입니다.
그 후 고정 용액을 폐기하고 부드러운 동요 하에서 실온에서 5 분 동안 PBS의 5 밀리리터를 추가하십시오. 그런 다음, PBS를 30%의 자당 5마리로 대체하고 조직 형태를 유지하기 위해 12~24시간 동안 배양한다. 이제 오르간이 접시 바닥에 가라앉습니다.
시료를 동결하려면 드라이 아이스를 대형 리셉터클에 넣고 약 50밀리리터의 순수 메탄올과 몇 조각의 드라이 아이스가 들어 있는 작은 리셉터클을 내부에 놓습니다. 비장을 보풀이 없는 닦아내기로 부드럽게 말리십시오. 기본 금형의 바닥에 OCT 화합물 한 방울을 드립하고 금형 내부에 비장을 놓습니다.
거품을 생산하지 않도록주의하십시오. 비장 위에 10월의 약 1밀리리터를 넣습니다. 집게로, 메탄올표면에 베이스 몰드를 증정하여 10월에 메탄올이 닿지 않도록 합니다.
10월은 두꺼워지고 얼면 흰색이 됩니다. 유물을 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 조직을 동결해야 합니다. 저온 마이크로토메에서 영하 20도의 온도로 설정합니다.
조직을 원하는 두께, 약 10 마이크로미터로 섹션. 브러쉬를 사용하여 유리 현미경 슬라이드에 섹션을 수집하고 시각적으로 검사합니다. 섹션이 실온에 도달하도록 허용합니다.
액체 차단제와 원을 그립니다,예를 들어, PAP 펜, 10 월 외부 조직 섹션 주위에. 조직이 건조되면 조직 섹션에 PBS 100 마이크로 리터를 5 분 동안 떨어 뜨리면 샘플을 다시 수화하십시오. 그런 다음 포부에 의해 섹션에서 PBS를 제거하고 샘플 섹션당 블로킹 솔루션 100 마이크로리터를 추가합니다.
실온에서 최소 1시간 동안 덮인 젖은 챔버에서 배양하십시오. 1차 항체로 염색하려면 차단 용액을 각 시료에 대해 제조된 1차 항체 혼합물로 대체한다. 원고에 따라 세척하기 전에 덮인 젖은 챔버에서 실온또는 하룻밤 동안 4 시간 동안 배양하십시오.
지금, 최적의 농도관심의 이차 항체를 희석, 일반적으로 밀리리터 당 2.5 마이크로 그램, 차단 용액에. 단부에서 최종 세척 용액을 제거하고 섹션 위에 준비된 이차 항체 믹스를 추가하고 덮인 젖은 챔버에서 실온에서 1 ~4 시간 동안 배양하십시오. 원고에 따라 세척 버퍼로 세척 한 후 세척 용액을 제거하고 PBS로 최종 세척을 수행합니다.
인산염 완충식식염을 흡인하고 나머지 PBS가 완전히 건조하지 않고 증발할 수 있도록 합니다. 슬라이드 뒷면의 섹션 주위에 원을 그립니다. 그런 다음, 샘플 위에 장착 매체를 한 방울 떨어뜨리고, 매체가 전체 섹션을 덮고 조심스럽게 커버 유리를 위에 놓는지 확인합니다.
샘플이 어둠 속에서 실온에서 하룻밤 동안 중합효소를 합시다. 아침에는 슬라이드를 반전된 스펙트럼 레이저 스캐닝 현미경 아래에 놓습니다. 사이토카인 세포 세포 화 분석을 위해 목표를 10배 NA 0.40 또는 60x NA 1.4로 조정한다.
이 프로토콜에서 인터페론 감마를 생성하는 셀이 시각화되고 위치합니다. 마커 F4/80은 모든 대식세포에 레이블을 지정하고 빨간색 펄프를 강조 표시합니다. 마커 B220은 B 세포를 표지하고 T 세포 영역을 둘러싼 B 세포 여포를 강조합니다.
마커 CD169는 흰색 펄프를 둘러싼 한계 영역 대식세포에 레이블을 지정합니다. 감염 후 24시간, 인터페론 감마는 활성항원 특이적 OT1 CD8 T 세포 및 NK 세포를 포함하는 다중 세포에 의해 생성된다. 비토카인 분비를 억제하기 위해 BFA를 사용하지 않고 NK 세포에 의한 인터페론 감마의 검출이 크게 손상되었다.
B 세포, 한계 영역 대식세포 및 모든 대식세포는 LM OVA 감염 에 따른 인터페론 감마 생성 세포의 위치를 묘사하기 위해 염색되었다. 흥미롭게도, 군집된 항원 특이적 T세포는 비장의 백색 펄프 전체에 위치하고 있지만, NK 세포가 공존하는 지역에서만 인터페론 감마를 생성한다. CD8 양성 T세포에 비해 인터페론 감마 및 NK의 상이한 세포세포 국소화가 나타났다.
NK 세포에서 인터페론 감마 국소화가 사이토솔에서 확산되었지만, CD8 양성 T 세포는 종종 다른 T 세포를 향해 인터페론 감마를 모집하였다. 브레펠딘 A의 주사는 시투에서 사이토카인을 검출하는 데 매우 중요합니다. 세포는 수시로 빨리 분비하고 사이토카인을 취하고 우리는 세포에 축적할 수 있도록 사이토카인 분비를 억제할 필요가 있습니다.
이 방법은 자신의 네이티브 환경에서 세포를 생산 하는 사이토카인을 다시 배치 하는 발견 도구. 이 환경의 조성물을 해독하면 인터페론 감마에 의해 영향을 받을 수 있거나 영향을 받을 수 있는 이 위치에 존재하는 올바른 세포 또는 면역 중재자에 집중할 수 있습니다. 조직에 있는 세포의 정확한 현지화가 그것의 기능에 중요하다는 것을 증가하는 이해가 있습니다.
우리의 프로토콜은 우리가 세포 생산 세포의 국소화를 식별하고, 따라서, 더 그 기능을 특성화 할 수 있습니다.
