Questo protocollo è significativo perché ci permette di visualizzare il microambiente in cui le cellule producono una data citochina, qui, gamma di interferone. È ammesso che la gamma di azione delle citochine è limitata perché i tessuti sono così complessi. È importante caratterizzare le cellule che circondano le cellule produttrici di gamma di interferone per individuare quali cellule lo riprenderanno.
Il principale vantaggio della tecnica è che non interrompe il microambiente presente nel tessuto di interesse. Inoltre, poiché non restimoliamo artificialmente le cellule per costringerle a produrre gamma di interferone, ci dà una migliore caratterizzazione se le cellule stanno effettivamente producendo attivamente gamma di interferone in situ. Questo protocollo potrebbe essere potenzialmente adattato ad altri organi e per la visualizzazione di altre citochine.
La maggior parte dei passaggi di questo protocollo sono semplici, ma la manipolazione del tessuto, il congelamento e la sessatura, devono essere eseguiti con cura per preservare l'integrità del tessuto. Per iniziare, trasferire 300 microlitri di LM coltivati geneticamente modificati in OAV espressi in un'infusione di cuore di brodo a 37 gradi Celsius in un pallone. Posizionare il pallone su uno shaker per un'agitazione delicata per far crescere l'LM in una fase esponenziale fino a quando l'OD600 raggiunge da 0,08 a 0,1.
Dopo aver diluito la coltura di OAV LM in PBS a una concentrazione di 0,1 volte la dose letale, il 50% utilizza una siringa per insulina calibro 29 per iniettare per via endovenosa 100 microlitri in C57 neri 6 destinatari di topi selvatici con cellule OT1 GFP o OT1 RFP. Per bloccare la secrezione di citochina 6 ore prima del sacrificio del topo, iniettare 250 microgrammi di BFA e 200 microlitri di PBS intraperitonealmente con la siringa per insulina calibro 29. Dopo l'eutanasia dei topi con anidride carbonica e la successiva lussazione cervicale, pulire l'addome con il 70% di etanolo.
Sul fianco sinistro del topo dove si trova la milza, tagliare la pelle con le forbici per fare un'incisione da uno a due centimetri. Quindi, fare con cura un'incisione nel peritoneo per esporre la milza e eserla con una pinzetta. Fare attenzione a non spremere con le forcette o tagliarlo per evitare di interrompere l'architettura della milza.
Ora, preparare la soluzione fissante mescolando 3,75 millilitri di PBS e 3,75 millilitri di L-lisina molare 0,2. Aggiungere 21 milligrammi di m-periodato di sodio e mescolare bene. Aggiungere quindi 2,5 millilitri di 4%PFA e 20 microlitri di 12 idrossido di sodio normale.
Tagliare la milza in tre parti. Immergere la milza nel fissatore in una piastra a sei porri e fissare per un minimo di quattro ore. Un tipico periodo di fissazione è da 16 a 20 ore a quattro gradi Celsius sotto delicata agitazione.
Successivamente, scartare la soluzione fissante e aggiungere cinque millilitri di PBS per cinque minuti a temperatura ambiente sotto delicata agitazione. Quindi, sostituire il PBS con cinque millilitri del 30% di saccarosio e incubare per 12-24 ore per mantenere la morfologia dei tessuti. Ora, l'organo affonda nella parte inferiore del piatto.
Per congelare il campione, mettere il ghiaccio secco in un grande contenitore e posizionare un recipiente più piccolo all'interno contenente circa 50 millilitri di metanolo puro e alcuni pezzi di ghiaccio secco. Asciugare delicatamente la milza su una salvietta priva di pelucchi. Gocciolare una goccia di composto oct nella parte inferiore dello stampo di base e posizionare la milza all'interno dello stampo.
Fare attenzione a non produrre bolle. Aggiungere circa un millilitro di OCT sulla milza. Con le forcep, depositare lo stampo di base sulla superficie del metanolo nel bagno di ghiaccio secco, assicurandosi che il metanolo non tocchi l'OCT.
Lo Strumento di personalizzazione di Office si addensa e diventa bianco quando viene congelato. Ricorda di congelare il tessuto il più rapidamente possibile per ridurre al minimo gli artefatti. Su un crio-microtomo, impostato sulla temperatura di meno 20 gradi Celsius.
Sessare il tessuto allo spessore desiderato, circa 10 micrometri. Utilizzare un pennello per raccogliere sezioni su vetrini al microscopio e ispezionare visivamente. Lasciare che le sezioni si aumentare a temperatura ambiente.
Disegnare un cerchio con blocco liquido, ad esempio una penna PAP, intorno alla sezione del tessuto all'esterno dello Strumento di personalizzazione di Office. Una volta che il tessuto si è asciugato, reidratare il campione gocciolando 100 microlitri di PBS sulla sezione tissutale per cinque minuti. Quindi, rimuovere il PBS dalla sezione per aspirazione e aggiungere 100 microlitri di soluzione di blocco per sezione del campione.
Incubare in una camera bagnata coperta per un minimo di un'ora a temperatura ambiente. Per macchiare con anticorpi primari, sostituire la soluzione di blocco con la miscela di anticorpi primari preparata per ogni campione. Incubare per quattro ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius in una camera bagnata coperta prima di lavarsi secondo il manoscritto.
Ora, diluire gli anticorpi secondari di interesse per una concentrazione ottimale, di solito 2,5 microgrammi per millilitro, nella soluzione di blocco. Rimuovere la soluzione di lavaggio finale dalla sezione e aggiungere la miscela di anticorpi secondari preparata sopra la sezione e incubare per una o quattro ore a temperatura ambiente in una camera umida coperta. Dopo il lavaggio con tampone di lavaggio secondo il manoscritto, rimuovere la soluzione di lavaggio ed eseguire un lavaggio finale con PBS.
Aspirare la salina tamponata dal fosfato e lasciare evaporare il PBS rimanente senza che la sezione si asciughi completamente. Disegnare un cerchio intorno alla sezione sul retro della diapositiva. Quindi, posizionare una goccia del supporto di montaggio sopra il campione, assicurandosi che il mezzo copra l'intera sezione e posizionare con cura un vetro di copertura sopra.
Lasciare che il campione polimerasi durante la notte a temperatura ambiente al buio. Al mattino, posizionare lo scivolo sotto un microscopio a scansione laser spettrale invertito. Regolare l'obiettivo a 10x NA 0.40 o 60x NA 1.4 per l'analisi della localizzazione subcellulare della citochina.
In questo protocollo, le cellule che producono gamma di interferone vengono visualizzate e localizzate. Il marcatore F4/80 etichetta tutti i macrofagi ed evidenzia la polpa rossa. Il marcatore B220 etichetta le cellule B ed evidenzia i follicoli cellulari B che circondano la zona delle cellule T.
Il marcatore CD169 etichetta i macrofagi delle zone marginali che circondano la polpa bianca. 24 ore dopo l'infezione, l'interferone gamma è prodotto da più cellule, incluse le cellule T OT1 CD8 specifiche dell'antigene attivato e le cellule NK. Senza l'uso del BFA per inibire la secrezione di citochine, il rilevamento della gamma di interferone da parte delle cellule NK è stato notevolmente compromesso.
Le cellule B, i macrofagi delle zone marginali e tutti i macrofagi sono stati macchiati per delineare la posizione delle cellule produttrici di gamma di interferone a seguito dell'infezione da OAV LM. È interessante notare che sono state trovate cellule T specifiche dell'antigene raggruppato situate in tutta la polpa bianca della milza, ma producono gamma di interferone solo nelle regioni in cui le cellule NK coesistevano con loro. È stata mostrata una diversa localizzazione subcellulare di gamma di interferone e NK rispetto alle cellule T positive cd8.
Mentre la localizzazione gamma dell'interferone nelle cellule NK era diffusa nel citosolo, le cellule T positive del CD8 spesso reclutavano gamma di interferone verso un'altra cellula T. L'iniezione di brefeldina A è fondamentale per rilevare la citochina in situ. Le cellule spesso secernono rapidamente e assevano le citochine e dobbiamo inibire la secrezione di citochina per lasciarla accumulare nelle cellule.
Questo metodo è uno strumento di scoperta che riporta le cellule produttrici di citochine nel loro ambiente nativo. Decifrare la composizione di questo ambiente ci permette di concentrarci sulle cellule giuste o mediatori immunitari presenti in questa posizione che possono avere un impatto o essere influenzati dalla gamma dell'interferone. C'è una crescente comprensione che la localizzazione precisa di una cellula in un tessuto è cruciale per la sua funzione.
Il nostro protocollo ci permette di identificare la localizzazione delle cellule produttrici di citochine e quindi, caratterizzarne ulteriormente la funzione.
