Этот протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет нам визуализировать микроокниронику, где клетки производят данный цитокин, здесь, интерферон гамма. Признано, что диапазон действия цитокинов ограничен, потому что ткани настолько сложны. Важно охарактеризовать клетки, которые окружают интерферон гамма-производящих клеток, чтобы определить, какие клетки будут принимать его.
Основным преимуществом техники является то, что она не нарушает микроокантиронию, присутствуют в ткани интереса. Кроме того, поскольку мы искусственно не переимулируем клетки, чтобы заставить их производить интерферон гамма, это дает нам лучшую характеристику того, клетки на самом деле активно производит интерферон гамма на месте. Этот протокол потенциально может быть адаптирован к другим органам и для визуализации других цитокинов.
Большинство шагов в этом протоколе просты, но обработка ткани, замораживание и раздел, должны быть выполнены с осторожностью, чтобы сохранить целостность ткани. Для начала перенесите 300 микролитров ЛМ, генетически модифицированных в выраженную OVA, в бульон настой сердца при 37 градусах Цельсия в колбу. Поместите колбу на шейкер для нежной агитации расти LM экспоненциальной фазы, пока OD600 достигает 0,08 до 0,1.
После разбавления культуры LM OVA в PBS до концентрации в 0,1 раза смертельной дозы, 50% используют 29-го калибра инсулина шприц внутривенно вводить 100 микролитров в C57 черный 6 диких получателей типа мышей подшипник OT1 GFP или OT1 RFP клеток. Чтобы заблокировать секрецию цитокинов за 6 часов до жертвоприношения мыши, ввимите 250 микрограммов BFA и 200 микролитров PBS интраперитонально с помощью инсулинового шприца 29-го калибра. После эвтанизации мышей с использованием двуокиси углерода и последующего вывиха шейки матки, очистить живот с 70%этанола.
На левом фланге мыши, где находится селезенка, прорезать кожу ножницами, чтобы сделать разрез от одного до двух сантиметров. Затем осторожно сделайте разрез в брюшной полости, чтобы разоблачить селезенку и вынести ее с помощью пинцета. Будьте осторожны, чтобы не сжать его с типсами или сократить его, чтобы избежать нарушения архитектуры селезенки.
Теперь подготовьте фиксативное решение, смешивая 3,75 миллилитров PBS и 3,75 миллилитров 0,2 молара L-лизина. Добавьте 21 миллиграмм м-периодата натрия и хорошо перемешайте. Затем добавьте 2,5 миллилитров 4%PFA и 20 микролитров 12 нормальных гидроксида натрия.
Разрежьте селезенку на три части. Погрузим селезенку в фиксатор в шести-хорошо пластины и исправить в течение как минимум четырех часов. Типичный период фиксации составляет от 16 до 20 часов при четырех градусах Цельсия под нежным возбуждением.
После этого отбросьте фиксатор раствора и добавьте пять миллилитров PBS в течение пяти минут при комнатной температуре при нежном возбуждении. Затем замените PBS на пять миллилитров 30% сахарозы и инкубировать в течение 12 до 24 часов для поддержания морфологии тканей. Теперь орган тонет в нижней части пластины.
Чтобы заморозить образец, поместите сухой лед в большой сосуд и поместите меньший сосуд внутри, содержащий около 50 миллилитров чистого метанола и несколько кусочков сухого льда. Аккуратно высушите селезенку на салфетке без ворса. Опустите каплю соединения OCT в нижней части базовой формы и поместите селезенку внутри формы.
Будьте осторожны, чтобы не производить пузырьки. Добавьте приблизительно один миллилитр OCT над селезенкой. С помощью типсов, депозит базовой формы на поверхности метанола в сухой ледяной ванне, убедившись, что метанол не касается OCT.
OCT будет утолщаться и стать белым, когда замороженные. Не забудьте заморозить ткани как можно быстрее, чтобы свести к минимуму артефакты. На крио-микротоме установлена температура минус 20 градусов по Цельсию.
Раздел ткани до желаемой толщины, около 10 микрометров. Используйте кисть для сбора разделов на стеклянный микроскоп слайды и проверить визуально. Позвольте секциям прийти к комнатной температуре.
Нарисуйте круг с жидким блокатором, например, ручкой PAP, вокруг секции ткани за пределами OCT. После того, как ткань высохла, регидратировать образец, капая 100 микролитров PBS на секции ткани в течение пяти минут. Затем удалите PBS из раздела путем устремления и добавьте 100 микролитров блокирующего раствора на раздел образца.
Инкубировать в покрытой мокрой камере в течение как минимум одного часа при комнатной температуре. Чтобы окрашивать первичные антитела, замените блокирующий раствор подготовленной первичной смесью антител для каждого образца. Инкубировать в течение четырех часов при комнатной температуре или на ночь при четырех градусах по Цельсию в покрытой мокрой камере перед стиркой в соответствии с рукописью.
Теперь разбавляют вторичные антитела, представляющие интерес для оптимальной концентрации, обычно 2,5 микрограмма на миллилитр, в блокирующий раствор. Удалить окончательный раствор мытья из раздела и добавить подготовленную вторичную смесь антитела на верхней части раздела и инкубировать в течение одного-четырех часов при комнатной температуре в покрытой мокрой камере. После мытья буфером мытья в соответствии с рукописью, удалить раствор мытья и выполнить окончательную стирку с PBS.
Аспирировать фосфат-буферный солевой раствор и позволить остальным PBS испаряться без раздела полностью высыхания. Нарисуйте круг вокруг раздела на задней части слайда. Затем поместите каплю монтажной среды поверх образца, убедившись, что среда покрывает весь раздел и аккуратно поместите крышку стекла на вершине.
Пусть образец полимеразы на ночь при комнатной температуре в темноте. Утром поместите слайд под перевернутый спектральный лазерный сканирующий микроскоп. Отрегулируйте цель до 10x NA 0.40 или 60x NA 1.4 для анализа субклеточной локализации цитокинов.
В этом протоколе клетки, которые производят интерферон гамма визуализированы и расположены. Маркер F4/80 маркирует все макрофаги и выделяет красную мякоть. Маркер B220 маркирует В-клетки и выделяет В-клеточные фолликулы, окружающие Т-клеточную зону.
Маркер CD169 маркирует маргинальные макрофаги зоны, окружающие белую мякоть. Через 24 часа после заражения, интерферон гамма производится несколькими клетками, в том числе активированный антиген-специфический OT1 CD8 Т-клеток и НК-клеток. Без использования BFA для ингибирования секреции цитокинов, обнаружение интерфероновой гаммы клетками НК было значительно нарушено.
В-клетки, макрофаги маргинальных зон и все макрофаги были окрашены, чтобы очертить расположение интерфероновой гаммы, производящей клетки после инфекции LM OVA. Интересно, что кластерные антиген специфические Т-клетки были найдены расположены по всей белой мякоти селезенки, но они производят интерферон гамма только в регионах, где НК-клетки сосуществовали с ними. Была показана различная субклеточная локализация интерферон гамма и НК по сравнению с CD8 положительными Т-клетками.
В то время как интерферон гамма-локализация в НК-клетках была рассеяна в цитозоле, положительные Т-клетки CD8 часто набирали интерферон гамму в сторону другой Т-клетки. Инъекция брефельдина А имеет решающее значение для обнаружения цитокинов на месте. Клетки часто быстро выделяется и принимают цитокины, и мы должны ингибировать секрецию цитокинов, чтобы она накапливаться в клетках.
Этот метод является инструментом открытия, который помещает обратно цитокинов производства клеток в их родной среде. Расшифровка состава этой среды позволяет нам сосредоточиться на правильных клетках или иммунных посредниках, присутствующих в этом месте, которые могут повлиять или быть под влиянием гамма-интерферона. Существует растущее понимание того, что точная локализация клетки в ткани имеет решающее значение для ее функции.
Наш протокол позволяет определить локализацию клеток, производящих цитокины, и тем самым дополнительно охарактеризовать его функцию.
