Es un tratamiento simple que se puede aplicar a cualquier línea de células madre o protocolo de diferenciación a las células principales para la diferenciación. Todo lo que uno tiene que hacer es agregar DMSO en 1-2% en el medio de mantenimiento de cultivo celular. La principal ventaja de esta técnica es que permite aumentar significativamente el potencial de diferenciación de las células madre pluripotentes en cualquier linaje de elección mediante el cebado de células para la diferenciación.
El tratamiento con DMSO aumenta la posibilidad de que las células se diferencien de los iPSC derivados del paciente, lo que les permite ser utilizadas para la terapia de reemplazo celular, el modelado de enfermedades y la detección de medicamentos. Puede dar lugar a la aparición temprana de la regulación que controla la sub-proliferación, diferenciación y especificación durante el desarrollo embrionario. Hemos demostrado que el tratamiento con DMSO mejora la diferenciación en casi 50 líneas de células madre pluripotentes embrionarias e inducidas por humanos.
Mientras que otros laboratorios han demostrado que es beneficioso para las células madre de otras especies, como el ratón y el primate. Un día antes del inicio de la diferenciación, agregue DMSO a una concentración de 1 o 2% durante 24 horas en su medio de mantenimiento típico. 24 horas después del tratamiento con DMSO, sustituya el medio y proceda con su protocolo de diferenciación habitual.
Cultivar células de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Cuando las células alcancen una confluencia adecuada, disociarlas y preparar una suspensión de una sola célula. Cuente las células vivas con un hemocitoómetro o un contador de celdas automático, utilizando un marcador de viabilidad como el azul tripano.
Con el fin de lograr una confluencia del 80-90% dentro del pretratamiento DMSO de 24 horas, vajilla las células en una placa recubierta de seis pozos a una densidad de 500.000 a 1 millón de células por pozo. Incubar las células durante 24 horas a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono. A continuación, aspire el medio y sustitúyalo por una solución de 1-2%DMSO.
Deje que las células se incuban durante 24-28 horas antes de la diferenciación. Si incuba durante 48 horas, sustituya el medio después de 24 horas con una solución DMSO fresca. Para lograr la diferenciación del cultivo 3D, crezca y recoja las células en una suspensión celular.
Cuente las células vivas y platéjelas en una placa de seis pozos sin recubrimiento y de baja fijación en medios de células madre con inhibidor DE ROCK. Típicamente, las esferas de células madre pluripotentes humanas 3D se formarán dentro de las 24 horas. Permita que las células se incuban durante 24 horas a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono.
Preparar 1-2%DMSO en medios de células madre precaleados de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Para reemplazar el medio después de la incubación, incline la placa a un ángulo de 30 grados a 45 grados y permita que las esferas celulares se asienten en la parte inferior del pozo. Aspirar los medios de las células y volver a suspenderlos suavemente en la solución DMSO.
Permita que las células se incuban durante 24-48 horas a 37 grados celsius en una incubadora de dióxido de carbono. Pre-tratar las células con DMSO como se describe para cultivos 2D, y preparar soluciones de stock noggin y SB431542. Prepare suficiente reemplazo de suero 10%knockout, o KOSR, en un DMEM noqueador durante tres a cuatro días de cambio de medios.
Preparar medios de diferenciación ectodérmica añadiendo noggin y SB431542 a KOSR knockout DMEM precalegado como se describe en el manuscrito. Después del pretratamiento de DMSO, aspirar medios de las células y añadir dos mililitros de medios de diferenciación a cada pozo. Permita que las células se incuban durante tres a cuatro días a 37 grados celsius en una incubadora de dióxido de carbono, reemplazando los medios diariamente con factores de diferenciación frescos.
El pretratamiento de DMSO da como resultado una disminución transitoria y dependiente de la dosis en la tasa de crecimiento celular en comparación con las células no tratadas. Esta disminución de la proliferación se asocia con un aumento en el contacto de célula a célula, que es especialmente pronunciado en las células tratadas con 2%DMSO. Cuando las células se fijan y se tiñen para los marcadores prototípicos de cada capa germinal, se puede observar que el pretratamiento de 2%DMSO da como resultado una mayor proporción de células de capa germinal diferenciadas.
Por ejemplo, SOX17 se tiñe para visualizar las células de endodermo. Con el fin de investigar el efecto de DMSO en la diferenciación a los tipos de células progenitoras del sistema nervioso central, las células madre pluripotentes inducidas por el hombre podrían diferenciarse en células progenitoras neuronales o células progenitoras de oligodendrocitos. En comparación con las células de control, el pretratamiento de 2%DMSO aumenta la expresión del marcador de células progenitoras neuronales Pax6.
Del mismo modo, el pretratamiento aumenta la proporción de células que expresan el marcador de células progenitores de oligodendrocitos Olig2. Además, el tratamiento inicial de DMSO mejora la función celular derivada de células madre embrionarias humanas después del trasplante in vivo. Cuando las células progenitoras pancreáticas diferenciadas se trasplantan en ratones inmunodeficientes, su funcionalidad se puede probar en respuesta a un desafío de glucosa o estimulación de KCl.
Las mejoras en la funcionalidad celular son evidentes de dos semanas a 16 semanas después del trasplante. La consideración más importante a tener en cuenta es el ciclo o el tiempo de duplicación de las células madre. La duración del tratamiento con DMSO debe ser la misma que la del tiempo de ciclo de las células.
Después del tratamiento inicial de DMSO, se puede entender cómo la proliferación celular y el ciclo celular se regulan en las células madre, como el tratamiento ayuda a promover la detención del crecimiento en la fase G1 del ciclo celular. Las células diferenciadas se pueden utilizar para comprender los mecanismos relacionados con la enfermedad, para el co-cultivo con otros tipos de células, en ensayos de tumorigenicidad, y en ensayos funcionales o estudios de trasplante para determinar si las células diferenciadas pueden rescatar un fenotipo de la enfermedad.
