É um tratamento simples que pode ser aplicado a qualquer linha de células-tronco ou protocolo de diferenciação às células prime para diferenciação. Tudo o que é preciso fazer é adicionar DMSO a 1-2% no meio de manutenção da cultura celular. A principal vantagem dessa técnica é que permite aumentar significativamente o potencial de diferenciação das células-tronco pluripotentes em qualquer linhagem de escolha, escorraçando células para diferenciação.
O tratamento com DMSO aumenta a chance de que as células se diferenciem dos iPSCs derivados do paciente, permitindo que sejam usados para terapia de substituição celular, modelagem de doenças e rastreamento de medicamentos. Pode dar origem ao início precoce da regulação que controla a sub-proliferação, a diferenciação e a especificação durante o desenvolvimento embrionário. Demonstramos que o tratamento DMSO melhora a diferenciação em quase 50 linhas de células-tronco pluripotentes embrionárias e induzidas.
Enquanto outros laboratórios mostraram que é benéfico para células-tronco de outras espécies, como rato e primata. Um dia antes do início da diferenciação, adicione DMSO a uma concentração de 1 ou 2% por 24 horas no seu meio de manutenção típico. 24 horas após o tratamento DMSO, substitua o meio e prossiga com o seu protocolo de diferenciação habitual.
Cultivar células de acordo com as instruções do manuscrito. Quando as células atingirem uma confluência apropriada, dissociá-las e preparar uma única suspensão celular. Conte as células vivas com um hemócito ou contador automático de células, usando um marcador de viabilidade, como o azul tripano.
Para alcançar 80-90% de confluência dentro do pré-tratamento DMSO de 24 horas, coloque as células em uma placa revestida de seis poços a uma densidade de 500.000 a 1 milhão de células por poço. Incubar as células por 24 horas a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono. Em seguida, aspire a mídia e substitua-a por uma solução DMSO de 1-2%.
Permita que as células incubam por 24-28 horas antes da diferenciação. Se incubar por 48 horas, substitua a mídia após 24 horas por uma nova solução DMSO. Para alcançar a diferenciação da cultura 3D, cresça e colete as células em uma suspensão celular.
Conte as células vivas e as emplaque em uma placa de seis poços não revestida e de baixa fixação na mídia de células-tronco com inibidor de ROCHA. Normalmente, as esferas de células-tronco pluripotentes humanas 3D se formarão dentro de 24 horas. Permita que as células incubam por 24 horas a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono.
Prepare 1-2% DMSO em mídia de células-tronco pré-aquecidas de acordo com as instruções do manuscrito. Para substituir a mídia após a incubação, incline a placa para um ângulo de 30 graus a 45 graus e permita que as esferas celulares se instalem na parte inferior do poço. Aspire a mídia das células e suspenda-as suavemente na solução DMSO.
Permita que as células incubam por 24-48 horas a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono. Pré-tratar células com DMSO como descrito para culturas 2D e preparar soluções de estoque noggin e SB431542. Prepare o suficiente 10% de substituição de soro de nocaute, ou KOSR, em DMEM nocaute para três a quatro dias de mudança de mídia.
Prepare a mídia de diferenciação ectodérmica adicionando noggin e SB431542 ao DMEM de nocaute KOSR pré-aquecido, conforme descrito no manuscrito. Após o pré-tratamento do DMSO, aspire a mídia das células e adicione dois mililitros de mídia de diferenciação a cada poço. Permita que as células incubam por três a quatro dias a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono, substituindo a mídia diariamente por novos fatores de diferenciação.
O pré-tratamento do DMSO resulta em uma diminuição transitória e dependente de doses na taxa de crescimento celular em comparação com células não tratadas. Essa diminuição da proliferação está associada ao aumento do contato celular-celular, que é especialmente pronunciado nas células tratadas com DMSO de 2%. Quando as células são fixas e manchadas para marcadores prototípicos de cada camada de germe, pode-se ver que 2% de pré-tratamento DMSO resulta em uma proporção aumentada de células de camada germinamentimentada diferenciadas.
Por exemplo, sox17 foi manchado para visualizar células de endoderme. A fim de investigar o efeito do DMSO na diferenciação para os tipos de células progenitoras do sistema nervoso central, as células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem poderiam ser diferenciadas em células progenitoras neurais ou células progenitoras oligodendrocyte. Em comparação com as células de controle, 2% do pré-tratamento DMSO aumenta a expressão do marcador celular progenitor neural Pax6.
Da mesma forma, o pré-tratamento aumenta a proporção de células expressando oligodendrocyte progenitor marcador celular Olig2. Além disso, o tratamento inicial de DMSO melhora a função celular derivada de células-tronco embrionárias humanas após o transplante in vivo. Quando células progenitoras pancreáticas diferenciadas são transplantadas em camundongos imunodeficientes, sua funcionalidade pode ser testada em resposta a um desafio de glicose ou estimulação de KCl.
Melhorias na funcionalidade celular são evidentes de duas semanas a 16 semanas após o transplante. A consideração mais importante a levar em conta é o tempo de ciclismo ou duplicação de suas células-tronco. O comprimento do tratamento DMSO deve ser o mesmo que o tempo de ciclismo das células.
Após o tratamento inicial do DMSO, pode-se entender como a proliferação celular e o ciclo celular são regulados em células-tronco, pois o tratamento ajuda a promover a prisão de crescimento na fase G1 do ciclo celular. As células diferenciadas podem ser utilizadas para compreender mecanismos relacionados à doença, para co-cultivo com outros tipos de células, em ensaios de tumorigenicidade, e em ensaios funcionais ou estudos de transplante para determinar se as células diferenciadas podem resgatar um fenótipo da doença.
