זהו טיפול פשוט שניתן להחיל על כל קו תא גזע או פרוטוקול התברואה לתאים ראשוניים להתברות. כל מה שאנחנו צריכים לעשות הוא להוסיף DMSO ב 1-2% לתוך מדיום תחזוקת תרבות התא. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת להגדיל באופן משמעותי את פוטנציאל ההידול של תאי גזע פלוריפוטנטיים לכל שושלת בחירה על ידי תאים ראשונים להתבולל.
טיפול DMSO מגדיל את הסיכוי שתאים יבדילו מ- iPSCs שמקורם בחולה, ויאפשרו להם לשמש לטיפול בתחליפי תאים, מידול מחלות והקרנת תרופות. זה יכול ללדת את תחילתה המוקדמת של רגולציה השליטה תת התפשטות, התברואה, ומפרט במהלך התפתחות עוברית. הוכחנו כי הטיפול ב- DMSO משפר את ההידול בכמעט 50 קווי תאי גזע עובריים ומושרים אנושיים.
בעוד מעבדות אחרות הראו כי זה מועיל עבור תאי גזע של מינים אחרים, כגון עכבר ופרימט. יום אחד לפני תחילת ההתביור, הוסף DMSO בריכוז של 1 או 2% למשך 24 שעות לתוך אמצעי התחזוקה הטיפוסי שלך. 24 שעות לאחר הטיפול ב- DMSO, החלף את המדיום והמשך בפרוטוקול ההידול הרגיל שלך.
לגדל תאים על פי הוראות כתב יד. כאשר התאים מגיעים לקונפליה מתאימה, נתק אותם והכן השעיה של תא יחיד. לספור את התאים החיים עם המוציטמטר או מונה תא אוטומטי, באמצעות סמן הכדאיות כגון כחול trypan.
על מנת להשיג 80-90% confluency בתוך 24 שעות ביממה DMSO טרום טיפול, צלחת התאים על צלחת מצופה שש באר בצפיפות של 500, 000 כדי 1 מיליון תאים ל הבאר. דגירה התאים במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני. לאחר מכן, שאפו את המדיה והחליפו אותה בפתרון DMSO של 1-2%..
אפשר לתאים דגירה במשך 24-28 שעות לפני ההידול. אם הדגירה למשך 48 שעות, החלף את המדיה לאחר 24 שעות בפתרון DMSO טרי. כדי להשיג התמדה תרבותית תלת-מימדית, לגדול ולאסוף את התאים בהשעיית תא.
לספור את התאים החיים צלחת אותם לא מצופה, קובץ מצורף נמוך שש בארות צלחת במדיה תאי גזע עם מעכבי רוק. בדרך כלל, כדורי תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים תלת-מימדיים ייווצירו תוך 24 שעות. אפשר לתאים להתמהמה במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני.
הכינו 1-2%DMSO במדיה של תאי גזע מחוממים מראש בהתאם לכיווני כתב היד. כדי להחליף את המדיה לאחר הדגירה, הטה את הצלחת לזווית של 30 מעלות עד 45 מעלות ואפשר לכדורי התא להתיישב בתחתית הבאר. שאפו את המדיה מהתאים והשעו אותם מחדש בעדינות בפתרון DMSO.
אפשר לתאים להתבגר במשך 24-48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני. טרום לטפל בתאים עם DMSO כמתואר עבור תרבויות 2D, ולהכין noggin ו SB431542 פתרונות מלאי. הכינו מספיק החלפת סרום של 10%, או KOSR, בנוקאאוט DMEM למשך שלושה עד ארבעה ימים של שינוי מדיה.
הכן מדיית בידול אקטודרמלית על-ידי הוספת נוגין ו- SB431542 ל- DMEM נוקאאוט KOSR מחומם מראש כמתואר בכתב היד. לאחר טיפול מקדים ב- DMSO, שאפו מדיה מתאים והוסיפו שני מיליליטר של מדיית התברואה לכל באר. אפשר לתאים להחגור במשך שלושה עד ארבעה ימים ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני, החלפת מדיה מדי יום עם גורמי הידול טריים.
תוצאות טרום טיפול DMSO בירידה ארעית ותלוית מינון בקצב צמיחת התאים בהשוואה לתאים שאינם מטופלים. ירידה זו קשורה לעלייה במגע בין תא לתא, אשר בולט במיוחד בתאים שטופלו ב- 2%DMSO. כאשר התאים קבועים ומוכתמים עבור סמנים prototypic של כל שכבת נבט, ניתן לראות כי 2%DMSO טרום טיפול תוצאות שיעור מוגבר של תאים שכבת נבט מובחן.
לדוגמה, SOX17 היה מוכתם כדי לדמיין תאי אנדודרמה. על מנת לחקור את ההשפעה של DMSO על הבחנה לסוגי תאי אבי מערכת העצבים המרכזית, תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם יכולים להיות מובחנים לתאי אבי עצביים או לתאי אבי אוליגודנדרוציטים. בהשוואה לתאי בקרה, 2%DMSO טרום טיפול מגביר את הביטוי של סמן תא אבי עצבי Pax6.
באופן דומה, טרום הטיפול מגדיל את שיעור התאים המבטאים אוליגודנדרוציטים סמן תאים אוליג2. יתר על כן, טיפול DMSO ראשוני משפר את תפקוד התאים האנושיים שמקורם בתאי גזע עובריים לאחר השתלת in-vivo. כאשר תאי אבות לבלב מובחנים מושתלים בעכברים immunodeficient, הפונקציונליות שלהם יכולה להיבדק בתגובה לאתגר גלוקוז או גירוי KCl.
שיפורים בפונקציונליות התא ניכרים משבועיים עד 16 שבועות לאחר ההשתלה. השיקול החשוב ביותר שיש לקחת בחשבון הוא זמן רכיבה על אופניים או הכפלה של תאי הגזע שלך. אורך הטיפול ב- DMSO צריך להיות זהה לזמן רכיבה על אופניים של התאים.
לאחר הטיפול הראשוני DMSO, אפשר להבין כיצד התפשטות התא ואת מחזור התא מוסדר בתאי גזע, כמו הטיפול מסייע לקדם מעצר צמיחה בשלב G1 של מחזור התא. התאים המובחנים יכולים לשמש להבנת מנגנונים הקשורים למחלות, לשיתוף עם סוגי תאים אחרים, בתקנות גידול, ובביקורים תפקודיים או מחקרי השתלה כדי לקבוע אם התאים המובחנים יכולים להציל פנוטיפ מחלה.
