RNA免疫沉淀，然后测序，或RIPiT-Seq，是一种确定RNA区域由一对特定RNA结合蛋白结合的方法。RIPIT 最独特的优势是它能够在两种纯化中定位两种不同的蛋白质。这为与其他复合物的组成不同RNA蛋白复合物的丰富提供了一种强有力的方法。
此外，RIPiT-Seq是UV-交叉链接独立的，可以应用于许多蛋白质，对RNA采取行动，而无需直接结合它。虽然这种方法不直接延伸到治疗或诊断，RNA结合蛋白和RNA处理已经与几个疾病，如神经病变和癌症相关。RIPiT-Seq为研究与疾病相关的RNA结合蛋白的功能提供了一个工具。
RIPiT-Seq 需要一个可以表达表位标记蛋白质的系统。它只在 HEK293 细胞中进行了测试，并且最易接受细胞培养。然而，现在，由于我们有能力使用CRISPR标记蛋白质，RIPiT-Seq可以适用于不同的现代系统。
RIPiT的成功取决于两种有效的免疫沉淀，因此优化所用抗体的免疫沉淀条件至关重要。此外，使用RNA需要适当的预防措施，因此在RNA提取期间和之后应使用无RNase试剂。证明这个程序将是劳伦伍德沃德，一个研究生在我的实验室。
首先用每15厘米板15毫升的冰镇PBS轻轻清洗单层细胞。然后刮掉细胞到30毫升PBS，并在50毫升锥形管中收集它们。在4摄氏度下以400克离心10分钟，将细胞进行离心，然后丢弃上一液。
加入四毫升冰冷低氧解液缓冲液，并使用P1000移液器重新悬浮细胞。将酸盐转移到五毫升管中，在冰上孵育10分钟。将酸盐放在冰浴中，然后根据手稿指示进行声波。
然后加入108微升的五摩尔氯化钠，将盐浓度调整为150毫摩尔。然后，在4摄氏度下将12，000克的利酸盐离心10分钟，并收集20微升的上光剂，用于西方的印迹分析。根据手稿方向预洗 FLAG agarose 珠子，并在五毫升管中将剩余的上一升珠涂抹到 750 微升珠上。
用细胞提取物孵育 FLAG agarose 珠子，在四摄氏度下用温和混合孵育一到三个小时。孵育后，在4摄氏度下以400克离心对珠子进行一分钟，并收集20微升的上经剂，用于西印分析。丢弃剩余的上流液，将珠子重新用四毫升的等洗缓冲液中重新填充。
再次将珠子取出，取出上一液。根据手稿方向在 750 微升等值缓冲液中稀释 RNase I，并将其添加到 FLAG agarose 珠子中。在四摄氏度下用温和的混合孵育混合物，然后通过离心将珠子颗粒入。
收集20微升的上光剂进行西印分析，并丢弃其余的。然后，用前文所述的等洗缓冲液清洗珠子。接下来，在珠子上加入375微升洗脱缓冲液，在4摄氏度下轻轻摇动混合物一到两个小时，进行亲和力洗脱。
孵育后，将珠子粒粒并收集15微升的洗脱等分，用于西部印迹分析。当亲和力洗脱进行时，执行磁珠抗体结合。首先在一毫升等值缓冲液中清洗50微升磁珠。
将珠子重新填充在100微升的结合缓冲液中，并加入适当量的抗体。然后，在室温下孵育珠子至少10分钟。用结合缓冲液清洗磁珠两次，并在 375 微升的 RIPiT 稀释缓冲液中重新悬浮磁珠。
将珠子储存在冰上，直到免疫沉淀。将 FLAG 亲和力洗脱应用于抗体耦合磁珠，并在四摄氏度下温和混合一至两小时。用磁铁捕获磁珠，并收集15微升上一升用于西方印迹分析。
然后，用等值缓冲液清洗珠子七次。在100微升透明样品缓冲器中重新悬浮磁珠，在冰上孵化悬浮液10分钟，继续变性洗脱。在孵育过程中，定期轻拂珠子以重新暂停。
捕获磁铁上的磁珠，并收集 15 微升洗脱用于西方印迹分析。将剩余的洗脱转移到新的1.5毫升管中。为了提取RNA，在RIPIT洗脱中加入320微升无RNase水和400微升苯酚-氯仿异酰醇。
涡流混合物，然后以12，000克离心5分钟。将水相的350微升收集到一个单独的管中。将醋酸钠、氯化镁、糖原和乙醇加入采集的样品中，并在负20摄氏度下孵育混合物过夜。
第二天，在12，000克的离心中对RNA进行颗粒，在4摄氏度下30分钟，用70%乙醇清洗。乙醇洗涤后，使用T4多核苷酸激酶（PNK）处理RNA，不含任何ATP，并按照手稿说明进行苯酚-氯仿纯化。将清洁的RNA重新在4.5微升无RNase水中。
为了量化RNA产量，请根据手稿指示用PNK和32P标记RNA进行放射性标记。使用低范围DNA梯和20至40核苷酸合成寡糖的大小和数量标准。在 26%尿素-聚丙烯酰胺凝胶上解析标记的 RNA。
根据手稿指示干燥凝胶，将凝胶暴露在磷屏上，直到检测到足够的信号。此技术已用于研究 exon 结复合体或 EJC 的相互作用。从RIPIT程序的每个主要步骤中纯化的蛋白质的西方印迹分析表明，纯化的EJC同时含有EIF4A3和MAGOH。
在洗脱中未检测到负控制 HNRNPA1。RNA足迹信号的强度与RNA蛋白相互作用量相关。当在用紫霉素治疗的细胞上执行 RIPIT 时，观察到更强的足迹，这增加了RNA上的EJC占用率。
为了确保 RIPIT 有效，通过西方污点测试 IP 的效率非常重要。在进行深度测序之前，评估RNA的量和质量也很重要。2018年，Singh实验室成功地利用这项技术净化了外型结复合物的两种组合不同变异，并识别了RNA结合模式。
如果研究人员选择通过自扫描检测RNA足迹，应遵循所有适当的辐射安全程序和协议。
