A imunoprecipitação de RNA em conjunto seguida pelo sequenciamento, ou RIPiT-Seq, é um método para identificar quais regiões do RNA estão vinculadas por um par específico de proteínas de ligação de RNA. A vantagem mais única do RIPiT é sua capacidade de atingir duas proteínas diferentes em duas purificações. Isso fornece uma maneira poderosa de enriquecer para um complexo de proteína RNA composicionalmente distinto de outros complexos.
Além disso, o RIPiT-Seq é independente de crosslinking UV, e pode ser aplicado a muitas proteínas que agem no RNA sem vinculá-lo diretamente. Embora este método não se estenda diretamente para a terapia ou diagnóstico, proteínas de ligação de RNA e processamento de RNA têm sido associados a várias doenças como neuropatias e câncer. O RIPiT-Seq fornece uma ferramenta para estudar funções de proteínas de ligação de RNA ligadas a doenças.
RIPiT-Seq requer um sistema onde uma proteína marcada por epítope possa ser expressa. Ele só foi testado em células HEK293, e é mais favorável à cultura celular. No entanto, agora com nossa capacidade de marcar proteínas usando CRISPR, ripit-seq pode ser aplicável a diversos sistemas modernos.
O sucesso do RIPiT depende de duas imunoprecipitações eficientes, por isso será fundamental otimizar as condições de imunoprecipitação para o anticorpo que está sendo usado. Além disso, trabalhar com RNA requer precauções adequadas, por isso os reagentes livres de RNase devem ser usados durante e após a extração do RNA. Demonstrando o procedimento será Lauren Woodward, uma estudante de pós-graduação no meu laboratório.
Comece lavando células de monocamadas suavemente com 15 mililitros de PBS refrigerado por placa de 15 centímetros. Em seguida, raspe as células em 30 mililitros de PBS e colete-as em um tubo cônico de 50 mililitros. Pelotar as células por centrifugação a 400 g por 10 minutos a 4 graus Celsius, e descartar o supernante.
Adicione quatro mililitros de tampão de hipotônico frio e use uma pipeta P1000 para suspender as células. Transfira o lysate para um tubo de cinco mililitros e incubar no gelo por 10 minutos. Coloque o lise em um banho de gelo e sonicato de acordo com as instruções do manuscrito.
Em seguida, adicione 108 microliters de cinco cloreto de sódio molar para ajustar a concentração de sal a 150 mililitros. Em seguida, centrifuugar o lysate a 12.000 g por 10 minutos a quatro graus Celsius, e coletar 20 microliters do supernatante para análise de manchas ocidentais. Pré-lavagem FLAG agarose contas de acordo com as instruções do manuscrito e aplicar remanescentes supernantes a 750 microliters de contas em um tubo de cinco mililitros.
Incubar as contas de agarose flag com o extrato celular por uma a três horas a quatro graus Celsius com mistura suave. Após a incubação, pelota as contas por centrifugação a 400 g por um minuto a quatro graus Celsius, e colete 20 microlitadores do supernatante para análise de manchas ocidentais. Descarte o restante do supernasciente e lave as contas resususundo-as em quatro mililitros de tampão de lavagem iso.
Pellule as contas novamente e remova o supernasce. Diluir RNase I em 750 microliters de tampão de lavagem iso de acordo com as instruções do manuscrito, e adicioná-lo às contas flag agarose. Incubar a mistura a quatro graus Celsius com mistura suave e, em seguida, pelotar as contas por centrifugação.
Colete 20 microliters de supernascer para análise de manchas ocidentais, e descarte o resto. Em seguida, lave as contas com tampão de lavagem iso como descrito anteriormente. Em seguida, realize a elução de afinidade adicionando 375 microliters de tampão de elução às contas, e sacudindo a mistura suavemente a quatro graus Celsius por uma a duas horas.
Após a incubação, pelota as contas e colete uma alíquota de 15 microliter da eluição para análise de manchas ocidentais. Enquanto a elução de afinidade está em andamento, realize a conjugação de anticorpos de contas magnéticas. Comece lavando 50 microliters de contas magnéticas em um mililitro de tampão de lavagem iso.
Resuspenja as contas em 100 microliters de tampão de conjugação e adicione a quantidade apropriada de anticorpo. Em seguida, incubar as contas por pelo menos 10 minutos em temperatura ambiente. Lave as contas magnéticas duas vezes com tampão de conjugação e resuspenja as contas em 375 microliters de tampão de diluição RIPiT.
Guarde as contas no gelo até a imunoprecipitação. Aplique a elução de afinidade FLAG às contas magnéticas acoplado a anticorpos e incubar com mistura suave por uma a duas horas a quatro graus Celsius. Capture as contas magnéticas com um ímã e colete 15 microliters de supernascer para análise de manchas ocidentais.
Em seguida, lave as contas sete vezes com o tampão de lavagem iso. Prossiga com a elução desnaturação, reutilizando contas magnéticas em 100 microliters de tampão de amostra clara e incubando a suspensão no gelo por 10 minutos. Durante a incubação, folhee periodicamente as contas para resuspensá-las.
Capture as contas magnéticas em um ímã e colete 15 microliters de elução para análise de manchas ocidentais. Transfira a elução restante para um novo tubo de 1,5 mililitro. Para extrair o RNA, adicione 320 microliters de água livre de RNase e 400 microliters de álcool isoamila fenol-clorofórmio à elução RIPiT.
Vortex a mistura e, em seguida, centrífuga-lo a 12.000 g por cinco minutos. Colete 350 microlitadores da fase aquosa em um tubo separado. Adicione acetato de sódio, cloreto de magnésio, glicogênio e etanol à amostra coletada e incubar a mistura durante a noite a 20 graus Celsius negativos.
No dia seguinte, pelota o RNA por centrifugação a 12.000 g por 30 minutos a quatro graus Celsius e lave-o em 70% de etanol. Após a lavagem do etanol, trate o RNA com t4 polinucleotídeo quinase, ou PNK, sem qualquer ATP, e realize a purificação fenol-clorofórmio de acordo com as instruções do manuscrito. Resuspenque o RNA limpo em 4,5 microliters de água sem RNase.
Para quantificar o rendimento do RNA, marque radiolabel o RNA com ATPs rotulados PNK e 32P de acordo com as instruções do manuscrito. Use uma escada de DNA de baixo alcance e um oligo sintético nucleotídeo de 20 a 40 para padrões de tamanho e quantidade. Resolva o RNA rotulado em um gel de 26%de ureia-poliacrilamida.
Seque o gel de acordo com as instruções do manuscrito e exponha o gel a um fósforo até que o sinal adequado seja detectado. Esta técnica tem sido usada para investigar as interações do complexo de junção de exon ou EJC. A análise ocidental das proteínas purificadas de cada passo principal do procedimento RIPiT mostra que o EJC purificado contém eif4A3 e MAGOH.
O controle negativo, HNRNPA1, não é detectado na eluição. A força do sinal de pegada de RNA se correlaciona com a quantidade de interação proteica RNA. Observa-se uma pegada mais forte quando o RIPiT foi realizado em células tratadas com puramicina, o que aumenta a ocupação do EJC no RNA.
Para garantir que o RIPiT tenha sido eficaz, é importante testar a eficiência do IP por mancha ocidental. Também é importante avaliar a quantidade e a qualidade do RNA antes de prosseguir com sequenciamento profundo. Em 2018, o laboratório Singh usou com sucesso essa técnica para purificar duas variações composicionalmente distintas do complexo de junção de exon e identificar padrões de ligação de RNA.
Se os pesquisadores optarem por detectar pegadas de RNA com autoradiografia, todos os procedimentos e protocolos adequados de segurança de radiação devem ser seguidos.
