使用点击化学测量血管平滑肌细胞增殖

增殖是细胞功能的重要指标。该协议允许调查人员在实验室中开发敏感的增殖检测，而无需支付商业上可用的试剂盒的高成本。这种技术的主要优点是避免了对细胞的严厉处理和/或使用放射性。

展示这种技术将是VickyWong，我的实验室经理。为了检测增殖，在96井板内DMEM中，以每毫升20，000个细胞取出具有平滑肌肉细胞介质的烧瓶中血管平滑肌肉细胞。一夜之间在37摄氏度下生长细胞。

将每毫升血小板30毫微克衍生生长因子添加到三至六孔，作为刺激增殖的正控制。然后将 PBS 添加到与负控相同的井数。孵育72小时。

稀释先前准备的五毫摩尔EdU库存到一毫摩尔，并在72小时培养期的最后24小时向每井添加两微升。保持一组没有 EdU 的复制，以确定背景荧光和发光。24小时后，通过去除介质修复细胞，然后每井添加150微升4%对甲醛，并在室温下孵育10分钟。

去除甲醛，每井在水中加入150微升1%TX-100，在室温下孵育30分钟。用 PBS 清洗三次以卸下 TX-100。要使用荧光检测合并的 EdU， 在使用前，通过按正确的顺序添加库存溶液中的试剂，每96井板生产10毫升标签溶液:20微升THPTA、20微升铜硫酸盐、5微升氟化丝丙烯酸酯和100微升磷酸钠，总体积为10毫升。

最关键的一步是在使用前制定标签解决方案。从井中去除PBS，在每口井中加入150微升标签溶液，并在37摄氏度下孵育30分钟。要检测所有核，请在每个井中添加 DAPI，并在荧光显微镜或成像板读卡器上添加图像。

为了避免手动计数，当成像板读取器不可用时，可以使用 HRP azide 和 ELISA 基板将该协议修改为发光读出。要使用亮度检测 EdU，首先准备三聚盐水与 0.1% 多糖酸 20。然后向每井添加150微升的阻尼缓冲液，并在室温下孵育90分钟。

取出阻塞缓冲液后，用200微升PBS清洗细胞三次。要检测整合的 EdU，首先通过按正确的顺序添加库存溶液中的试剂，准备每 96 井板 10 毫升标签解决方案。首先，20微升THPTA，然后20微升硫酸铜，5微升生物素皮二醇-二氧化氮，100微升钠抗坏血胶到PBS的总体积为10毫升。

用200微升的TBST用震动洗井五次三分钟。在室温下用150微升0.3%过氧化氢淬火内源性过氧化物20分钟。去除过氧化氢后，用200微升的TBST用震动洗涤5次，3分钟。

在每孔中加入50微升稀释的链球菌素-马萝卜过氧化物酶，并在室温下孵育一小时。用 200 微升的 TBST 用震动洗五次三分钟。将 50 微升的化学发光 ELISA 基板添加到每个井中，并立即在能够检测发光的板读卡器中读取。

虽然荧光核可以通过标准荧光板读取器检测，但使用发光方案，荧光扫描被转换为用链球菌素-马萝卜过氧化物酶和标准ELISA基质检测出的均匀液体读出。与荧光读出相比，此方法的优点是更均匀的读出，当测量 VSMC 响应 PDGF 的增殖时，可以在几秒钟内读取该板。缺点是背景高于荧光，因此负控制往往更高。

为了减少变异性，结果被规范化为初始细胞计数。然而，在一组单独的实验中，它表明这种方法不够敏感，无法检测细胞数的小差异。计算EdU阳性和总细胞的最有效和最准确的方法是使用成像板读卡器。

如果没有这种类型的板读卡器，手动计数也将产生准确的结果。比较这两种方法时，EdU 正手动计数与自动计数相同，未加速计数的总计数相同。这两种方法的优点是可计数的细胞的可见性，提高了精度，并可以看到和避免了碎片的非特异性染色。

手动计数方法的主要缺点是时间。请记住，在使用前使标签解决方案新鲜，并按书面协议中提供的顺序添加成分。如果染色强度暗淡，请尝试调整切合器与铜的比例。

请记住，甲醛是有毒的。戴手套时应用在烟罩中。该过程本身并不难，但可能需要通过调整贴标溶液中的溷合器与铜比来优化。

此外，EdU 治疗的孵化时间和长度可以根据细胞类型和所问的具体问题进行调整。该技术与细胞表面和细胞内染色兼容，因此可以确定分裂和非分裂细胞的特性。虽然通常用于测量增殖，但点击化学也可用于RNA、蛋白质、脂肪酸和碳水化合物的代谢标记。

如果感兴趣的代谢靶点在细胞表面，活细胞可以标记。