الانتشار هو مقياس مهم لوظيفة الخلية. يسمح هذا البروتوكول للمحققين بتطوير تحليل حساس للانتشار في مختبراتهم دون التكلفة العالية للأطقم المتاحة تجاريًا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتجنب المعاملة القاسية للخلايا و / أو استخدام النشاط الإشعاعي.
إثبات هذه التقنية ستكون فيكي وونغ، مديرة مختبري. إلى الانتشار المقايسة, إزالة خلايا العضلات السلس الأوعية الدموية من قارورة مع وسائط خلية العضلات الملساء في مصل الأبقار الجنينية 2٪ وطبقة في 20,000 خلية لكل ملليلتر في DMEM في لوحة 96-جيدا. تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
أضف 30 نانوغرام لكل مليلتر من معامل النمو المشتق من الصفائح الدموية إلى ثلاثة إلى ستة آبار كتحكم إيجابي لتحفيز الانتشار. ثم إضافة برنامج تلفزيوني إلى نفس عدد الآبار كتحكم سلبي. احتضان لمدة 72 ساعة.
تم تخفيف مخزون EdU الذي سبق إعداده من خمسة ملليمولار إلى ملليمولار واحد وإضافة اثنين من ميكرولترات إلى كل بئر لآخر 24 ساعة من فترة الثقافة 72 ساعة. احتفظ بمجموعة واحدة من النسخ المتماثلة بدون EdU لتحديد الفلورية والإنارة الخلفية. بعد 24 ساعة، قم بإصلاح الخلايا عن طريق إزالة الوسائط، ثم إضافة 150 ميكرولترات لكل بئر من 4٪ شبهformaldehyde واحتضان 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
إزالة شبهformaldehyde وإضافة 150 ميكرولترات من 1٪ TX-100 في الماء في البئر الواحد واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. غسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة TX-100. للكشف عن EdU المدمج باستخدام الفلوريسنس، جعل 10 ملليلتر من وضع العلامات حل لكل لوحة 96-well فقط قبل استخدامها عن طريق إضافة الكواشف من حلول الأسهم في الترتيب الصحيح: 20 microliters THPTA، 20 microliters كبريتات النحاس، خمسة ميكرولتررز الفلوريسين بيكوليل أزيد، و 100 ميكرولترز الصوديوم اسكوربات في PBS لحجم إجمالي قدره 10 ملليلتر.
الخطوة الأكثر أهمية هو جعل الحل وضع العلامات قبل الاستخدام. إزالة برنامج تلفزيوني من الآبار، إضافة 150 ميكرولترات من حل وضع العلامات إلى كل بئر واحتضان 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. للكشف عن جميع النوى، أضف DAPI إلى كل بئر وصورة على المجهر الفلوري أو قارئ لوحة التصوير.
لتجنب العد اليدوي وعندما لا يتوفر قارئ لوحة تصوير، يمكن تعديل هذا البروتوكول إلى قراءة الإنارة باستخدام AZIDE HRP وركيزة ELISA. للكشف عن EdU باستخدام الإنارة، قم أولاً بإعداد محلول ملحي ثلاثي المخزن مع 0.1٪ بوليسوربات 20. ثم إضافة 150 ميكرولترات من العازلة حظر إلى كل بئر واحتضان لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد إزالة العازلة حجب، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. للكشف عن EdU المدمجة، أولا إعداد 10 ملليلتر من حل وضع العلامات لكل لوحة 96-well بإضافة الكواشف من حلول الأسهم في الترتيب الصحيح. أولا، 20 ميكرولترات THPTA، ثم 20 microliters كبريتات النحاس، وخمسة ميكروليترز بيكوليل أزيد، 100 ميكرولترات الصوديوم اسكوربات في برنامج تلفزيوني لحجم إجمالي قدره 10 ملليلتر.
غسل الآبار خمس مرات ثلاث دقائق مع 200 ميكرولترات من TBST مع اهتزاز. بيروكسيداسية quench الذاتية مع 150 ميكرولترات من 0.3٪ بيروكسيد الهيدروجين لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة بيروكسيد الهيدروجين، وغسل خمس مرات ثلاث دقائق مع 200 ميكرولترات من TBST مع اهتزاز.
إضافة 50 ميكرولترات من بيروكسيديز streptavidin-الفجل المخفف في TBST إلى كل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. غسل خمس مرات ثلاث دقائق مع 200 ميكرولترات من TBST مع اهتزاز. إضافة 50 ميكرولترات من الركيزة ELISA chemiluminescent إلى كل بئر وقراءة على الفور في قارئ لوحة قادرة على الكشف عن الإنارة.
على الرغم من أنه يمكن الكشف عن النوى الفلورية من قبل قارئ لوحة الفلوريسين القياسية، وذلك باستخدام بروتوكول الإنارة، يتم تحويل المسح الفلوري إلى قراءات سائلة متجانسة تم اكتشافها مع بيروكسيديز streptavidin-horseradish وركيزة ELISA القياسية. وميزة هذه الطريقة مقارنة مع قراءات الفلورسنت هو قراءات أكثر تجانسا ويمكن قراءة لوحة في ثوان كما رأينا هنا عندما تم قياس انتشار VSMC استجابة لPGF. العيب هو أن الخلفية هي أعلى من مع fluorescence ، وبالتالي الضوابط السلبية تميل إلى أن تكون أعلى.
في محاولة لتقليل التباين، تم تطبيع النتائج إلى عدد الخلايا الأولية. ومع ذلك، في مجموعة منفصلة من التجارب، فقد تبين أن هذا الأسلوب غير حساس بما يكفي للكشف عن اختلافات صغيرة في أرقام الخلايا. الطريقة الأكثر كفاءة ودقة لحساب الخلايا الإيجابية والإجمالية EdU هي باستخدام قارئ لوحة التصوير.
إذا لم يتوفر هذا النوع من قارئ اللوحة، فإن العد اليدوي سيؤدي أيضًا إلى نتائج دقيقة. عند مقارنة هاتين الطريقتين، كان العد اليدوي الموجب لـ EdU مطابقًا للعد الآلي كما كان إجمالي عدد المجاميع غير المُحَرَّة. وميزة هاتين الطريقتين هي رؤية الخلايا التي يتعين عدها، وتحسين الدقة، وأنه يمكن رؤية التلطيخ غير النوعي للحطام وتجنبه.
العيب الرئيسي مع طريقة العد اليدوي هو الوقت. تذكر لجعل حل وضع العلامات الطازجة فقط قبل استخدامها وإضافة المكونات في النظام المنصوص عليها في بروتوكول مكتوب. إذا كانت شدة تلطيخ خافتة، حاول ضبط نسبة الشُل إلى النحاس.
تذكر أن ما قبل الفورمالدلديهايد هو السامة. وينبغي استخدامه في غطاء الدخان أثناء ارتداء القفازات. الإجراء في حد ذاته ليس من الصعب ولكن قد تحتاج إلى أن تكون الأمثل عن طريق ضبط chelator إلى نسب النحاس في حل وضع العلامات.
بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تعديل أوقات الحضانة وطول علاج EdU اعتمادًا على نوع الخلية والسؤال المحدد الذي يتم طرحه. هذه التقنية متوافقة مع سطح الخلية والتلطيخ داخل الخلايا بحيث يمكن تحديد خصائص الخلايا المقسمة وغير المقسمة. على الرغم من أن تستخدم عادة لقياس الانتشار، انقر على الكيمياء يمكن أيضا أن تستخدم لوضع العلامات الأيضية من الحمض النووي الريبي والبروتينات والأحماض الدهنية والكربوهيدرات.
إذا كان الهدف الأيضي من الفائدة على سطح الخلية، يمكن تسمية الخلايا الحية.
