Распространение является важной мерой функции клеток. Этот протокол позволяет следователям разрабатывать чувствительные анализы распространения в своих лабораториях без высокой стоимости коммерчески доступных комплектов. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет избежать жесткого лечения клеток и/ или использования радиоактивности.
Демонстрацией этой техники будет Вики Вонг, менеджер моей лаборатории. Для анализа пролиферации удалите сосудистые гладкие мышечные клетки из колбы с гладкими мышечными клетками в сыворотке крови 2%fetal bovine и пластине на 20 000 клеток на миллилитр в DMEM в пластине из 96 колодец. Выращиваем клетки при 37 градусах Цельсия за одну ночь.
Добавьте 30 нанограмм на миллилитр тромбоцитов, полученных фактор роста до трех-шести скважин в качестве положительного контроля для стимулирования пролиферации. Затем добавьте PBS к тому же количеству скважин, что и отрицательный контроль. Инкубация в течение 72 часов.
Разбавить ранее подготовленные пять миллимолейных запасов EdU до одного миллимолара и добавить два микролитров к каждой хорошо в течение последних 24 часов 72 часов периода культуры. Храните один набор репликаций без EdU для определения фоновой флуоресценции и люминесценции. Двадцать четыре часа спустя, исправить клетки, удалив средства массовой информации, а затем добавить 150 микролитров на колодец 4%paraformaldehyde и инкубировать 10 минут при комнатной температуре.
Удалите параформальдегид и добавьте 150 микролитров по 1%TX-100 в воду на колодец и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. Вымойте три раза с PBS, чтобы удалить TX-100. Для обнаружения включенного ЭдУ с помощью флуоресценции, сделать 10 миллилитров маркировки раствора на 96-хорошо пластины непосредственно перед использованием, добавив реагенты из фондовых решений в правильном порядке: 20 микролитров THPTA, 20 микролитров медного сульфата, пять микролитров флуоресцента пикорил-азида, и 100 микролитров аскорбата натрия в PBS для общего объема 10 миллилитров.
Наиболее важным шагом является сделать решение для маркировки непосредственно перед использованием. Удалить PBS из скважин, добавить 150 микролитров маркировки раствора для каждой скважины и инкубировать 30 минут при 37 градусов по Цельсию. Чтобы обнаружить все ядра, добавьте DAPI к каждому колодец и изображение на флуоресцентном микроскопе или считыватель пластин изображений.
Чтобы избежать ручного подсчета и когда считыватель пластин изображений недоступен, этот протокол может быть изменен на считывание люминесценции с помощью HRP azide и субстрата ELISA. Чтобы обнаружить ЭдУ с помощью яркости, сначала подготовь трис-буферный солевой раствор с 0,1%полисорбатом 20. Затем добавьте 150 микролитров блокирующего буфера к каждой колодец и инкубировать в течение 90 минут при комнатной температуре.
После удаления блокирующего буфера, мыть клетки три раза с 200 микролитров PBS. Чтобы обнаружить включенный EdU, сначала подготовьте 10 миллилитров маркировки раствора на 96-колодец пластины, добавив реагенты из фондовых решений в правильном порядке. Сначала 20 микролитров THPTA, затем 20 микролитров медного сульфата, пять микролитров биотин пиколита-азида, 100 микролитров аскорбата натрия в PBS общим объемом 10 миллилитров.
Вымойте скважины пять раз три минуты с 200 микролитров TBST со тряской. Утолить эндогенные пероксиды со 150 микролитров 0,3%перекиси водорода в течение 20 минут при комнатной температуре. После удаления перекиси водорода, мыть пять раз три минуты с 200 микролитров TBST со тряской.
Добавьте 50 микролитров разбавленного стрептавидина-хрена пероксидазы в TBST к каждой колодец и инкубировать при комнатной температуре в течение одного часа. Вымойте пять раз три минуты с 200 микролитров TBST со тряской. Добавьте к каждому колодец 50 микролитров хемилюминесцентного субстрата ELISA и немедленно прочитайте в считыватель пластин, способный обнаруживать люминесценцию.
Хотя флуоресцентные ядра могут быть обнаружены стандартным считывателем пластин флуоресценции, используя протокол люминесценции, флуоресцентное сканирование преобразуется в однородное жидкое считывание, обнаруженное с пероксидазом стрептавидина-хрена и стандартным субстратом ELISA. Преимущество этого метода по сравнению с флуоресцентным считыванием является более однородным считыванием, и пластина может быть прочитана в считанные секунды, как поменьше здесь, когда было измерено распространение VSMC в ответ на PDGF. Недостатком является то, что фон выше, чем при флуоресценции, поэтому отрицательный контроль, как правило, выше.
В попытке уменьшить изменчивость результаты нормализовались до первоначального количества клеток. Однако в отдельном наборе экспериментов было показано, что этот метод недостаточно чувствителен для обнаружения небольших различий в числах клеток. Наиболее эффективным и точным способом подсчета положительных и полных ячеек EdU является использование считыватель пластин изображений.
Если этот тип считыватель пластин недоступен, ручной подсчет также даст точные результаты. При сравнении этих двух методов положительное ручное количество EdU было идентично автоматическому подсчету, как и общее количество нестимулированных. Преимуществом этих двух методов является видимость клеток, которые должны быть подсчитаны, улучшена точность, и что неспецифическое окрашивание мусора можно увидеть и избежать.
Основным недостатком метода ручного подсчета является время. Не забудьте сделать решение для маркировки свежим непосредственно перед использованием и добавить ингредиенты в порядке, представленном в письменном протоколе. Если интенсивность окрашивания тусклая, попробуйте настроить соотношение хелатора и меди.
Помните, что параформальдегид токсичен. Он должен быть использован в дым капот во время ношения перчаток. Сама процедура не является сложной, но, возможно, потребуется оптимизировать путем корректировки хелатора на медные соотношения в решении маркировки.
Кроме того, время инкубации и продолжительность лечения ЭдУ могут быть скорректированы в зависимости от типа клетки и конкретного вопроса. Этот метод совместим с поверхностью клеток и внутриклеточным окрашиванием, так что характеристики деления и неразделения клеток могут быть определены. Хотя обычно используется для измерения пролиферации, нажмите химии также могут быть использованы для метаболической маркировки РНК, белков, жирных кислот и углеводов.
Если метаболическая цель интереса находится на поверхности клетки, живые клетки могут быть помечены.
