从多能干细胞中无血清自由生产三维人类肝球

这种用精细材料和组装细胞的三维造血球大量造血。这项技术的主要进步是，它允许控制3D肝球的大小，限制坏死中心的形成和表型的丧失。与我一起演示这个程序的将是王宇，一个博士后在我们的实验室。

准备通过溶解两克低熔化温度的气糖在100毫升的灭菌蒸馏水中呈现阿加罗斯模具。小心加热微波炉中的混合物，间隔摇动，以完全溶解糖。将 520 微升熔化的阿加罗斯添加到 256 个格式良好的模具中，并允许其凝固。

然后，将每个加糖微板转移到一个12井板的单一井中。在每个井中加入1.5毫升的DPBS，加入钙和镁，上下移液器以去除气泡。要准备细胞悬浮，首先从人类多能干细胞（HPSC）的未分化培养中吸出培养基。

通过添加五毫升室温 DPBS、钙或镁来冲洗细胞，然后取出缓冲液。向细胞中加入5毫升细胞分离试剂，在37摄氏度下孵育6至8分钟。在显微镜下观察细胞分离，如果需要，将孵育时间延长一到两分钟。

通过去除细胞分离试剂和添加5毫升新鲜MT，提供一种介质，辅以10微摩尔岩石抑制剂Y27632，停止反应。上下移液几次，以分离细胞。使用血细胞计计算可行细胞，并尝试蓝色染色，以计算所需的细胞总数。

将所需数量的细胞转移到无菌的15或50毫升离心管中，并在200倍G下离心5分钟，对细胞进行分粒。丢弃上一级，重新悬浮MT中的细胞，用10微摩尔岩石抑制剂提供一种介质，最终浓度为每毫升210万个细胞。接下来，通过每阿加罗斯微井添加190微升的已准备好细胞悬浮液，并在37摄氏度的二氧化碳中孵育37摄氏度，两小时， 从而拯救细胞。

孵育后，在每一个井中加入一毫升新鲜、温暖、T-服务一种带岩石抑制剂的介质。将盘子返回孵化器，并在那里保留 24 小时。第二天，检查地层。

在 95% 乙醇的 100 毫升中溶解两克多血血氢，并在 55 摄氏度的热板上搅拌溶液，准备聚二羟基甲基甲基丙烯酸酯或多血氢涂层井。第二天，在24井板的每个井中加入250微升溶液，在60摄氏度的烤箱中将盘子干燥过夜。通过小心地去除MT，从先前播种的细胞中去除一种介质，并用一毫升的新鲜内多德姆分化介质代替，启动肝细胞分化。

对于人类胚胎干细胞，每24小时刷新一次，为期三天。在播种后24小时启动肝细胞分化，以避免自发细胞分化， 这一点很重要。在确定内极诱导后，将介质切换到肝细胞分化介质五天。

每两天更换一次介质，在肝细胞规格的最后一天执行最后一次更改。要将肝层转移到准备好的多血球涂层井中，用肝细胞成熟介质清洗细胞，然后加入一毫升的介质，每毫升HGF和每毫升OSM补充10毫微克和20毫微克。多次上下移液溶液，将肝圈从红玫瑰微板中提起，并转移到多血球涂层井中。

用一毫升补充的肝细胞成熟介质清洗阿加罗斯微板，将介质转移到多血球涂层。使用P-100移液器，小心吸升多余的介质，而不去除肝圈，直到井中还剩下大约一毫升的介质。每 48 小时刷新一次介质，12 天。

如果使用胚胎干细胞，在第20天通过去除成熟介质，用维持介质清洗细胞，然后加入一毫升补充维持介质，将介质切换到肝细胞维持介质。在此之后，每 48 小时刷新一次媒体。必须仔细进行立即更改，以避免这种球形结构的严重应力和扭曲。

在间质标记物中对肝细胞的染色令人陶醉，即使用这种技术形成的肝细胞由围绕间质细胞核心的肝细胞组成的细胞组成。在肝细胞中通常表达的其他蛋白质也存在于球体的外层。细胞色素P450酶或CYP在30天肝层培养物的功能分析表明，3D球体的CYP活性与人类原发性肝细胞相比，表现出可敬的CYP活性水平。

此外，可以证明，肝层分泌肝脏蛋白，如白蛋白和阿尔法-费托蛋白。对于该协议，要记住的最重要的事情是，在将含有 3D 肝层的溶液转移到多血球涂层板时，轻轻移液。这有助于避免损坏它们。

一旦掌握，这种方法允许生成3D肝球，保持功能超过一年的体外与多种应用在死亡建模和药物筛选。展望未来，该技术可以作为平台，以开发具有复杂结构的进一步内皮和间质组织。