抗体喂养方法研究分离原发性希马培养物中的谷氨酸受体贩运

细胞对外部刺激的反应严重依赖在给定时刻在细胞表面表达的一组蛋白质。因此，这些蛋白质的数量、亚细胞定位和亚单位组成是动态控制的。在这里，我们将使用抗体喂养方法量化细胞培养物中表面表达受体的水平，只要内化和回收恢复。

这是一个非常通用的协议，提供表面表达蛋白质的调节的机械信息。在我们的示例中，我们将研究初级海马神经元中的谷氨酰胺受体。该协议可以适应任何蛋白质拥有一个原基因细胞外表位，如果没有抗体，转出标记结构可以有用的标记和研究特定的突变。

在我们的示例中，我们使用抗体对抗内源性 GluA1，并标记 Glu12 B.To 开始此过程，将盖滑细胞侧转移到石蜡膜覆盖的托盘上，以保存试剂，并促进操作。保存和维护37摄氏度的有条件介质，用于孵化和清洗步骤。在室温下用在条件介质中稀释的原抗体孵育细胞15分钟。

在此之后，使用真空移液器小心吸出含有介质的抗体，并使用条件介质清洗细胞三次。如果研究表面与细胞内受体表达，则在此步骤之后修复具有半蛋白醛的细胞，如文本协议中所述。保持在条件介质中的细胞没有抗体，并在37摄氏度下将它们返回到培养箱，以便进行内化。

如果研究内化过程，在此步骤后修复具有甲状醛的细胞，如文本协议中所述。要阻断附着在表面表达受体上未内化的原抗体上的表位，用未结合的 Fab 抗 IgG 抗体片段孵育细胞，在室温下稀释 20 分钟。在此之后，用条件介质清洗细胞三次。

在37摄氏度下用含有80微摩尔Dynasore的调节介质孵育洗净的井，以便回收内化受体。完成活细胞的修改后，用PBS加洗一次细胞。在PBS中加入4%的甲醛和4%蔗糖的溶液，并在室温下在烟罩中孵育7至8分钟，以修复细胞。

然后用常规PBS清洗细胞三次。在PBS中加入10%正常山羊血清溶液，并在室温下孵育30分钟，以阻止非特异性结合位点。接下来，在室温下用荧光标记二次抗体在PBS中稀释3%NGS的细胞孵育一小时，以标记初级抗体标签受体。

在此之后，用PBS清洗细胞三次。要开始标记细胞内受体，在PBS中加入0.25%TritonX溶液，并在室温下孵育5至10分钟，使细胞渗透。然后在室温下用10%NGS进行30分钟的阻滞。

如果研究表面与总，孵育细胞与以前使用的相同原抗体，稀释与3%NGS在PBS，在室温一小时，标签细胞内受体。接下来，用PBS清洗细胞三次。标签与第二荧光标记的二次抗体，稀释在3%NGS在PBS，在室温下一小时。

在此用 PBS 洗三次细胞后。首先轻轻地将盖滑，细胞侧向下，在12至15微升的适当安装介质上安装细胞。然后在适当的共合显微镜上成像细胞，并分析文本协议中概述的细胞。

此研究谷氨酸受体贩运的协议基于在细胞表面和在内部膜中表达的受体的鉴别标记。获得共体图像后，荧光信号可以很容易地量化，以显示表面表达的增加，相对于细胞内人口，遵循化学LTP。在非渗透细胞中无法获得PSD-95信号，这证明了等离子膜的完整性。

这表明表面GluA1获得的信号确实对应于表面表示受体。重要的是，在非渗透条件下，可以观察到内化GluA1的最小信号，表明所有表面表位都被初始抗体标签所占据。然后识别内化的受体。

这个例子突出了S1480的GluN2B磷酸化促进受体内化。与野生型受体相比，磷化突变体S1480E的内化率要高得多。正如预期的那样，在控制中，内化受体不会获得任何信号。

接下来，确定回收受体和内化受体。产生的回收率表明GluN2B S1480E对NMDAR回收没有影响。在控制中，在没有 Fab 阻塞的情况下，可以观察到表面表示 GluN2B 的强烈信号。

该信号在 Fab 处理的培养文化中消失，表明阻断协议足以完全阻断表面表达的表位，并且回收后观察到的表面信号确实与贩运回等离子膜的受体相对应。目前的协议只是可用于研究表面表达蛋白调控的方法之一。也可以采取其他方法来扩展或验证此处获得的数据。

这些方法包括生化方法，如生物基化、生命成像技术或功能方法，如电生理学或钙成像。我们使用PFA冻结受体的定位，但是PFA是已知的致癌物质，因此在戴合适的PPE时，在烟罩下使用PFA执行步骤至关重要。