Dış uyaranlara hücresel tepkiler ağır belirli bir anda hücre yüzeyinde ifade edilen proteinlerin kümesine bağlıdır. Buna göre, bu proteinlerin sayısı, alt hücresel lokalizasyonu ve alt birim bileşimi dinamik olarak kontrol edilir. Burada, hücre kültürlerinde ifade edilen reseptörlerin seviyesini ölçmek için bir antikor besleme yaklaşımı kullanacağız, sürece içselleştirme ve geri dönüşüm devam eder.
Bu çok yönlü bir protokoldür, yüzey ifade proteinlerin düzenlenmesi mekanik bilgi sağlar. Örneğimizde, primer hipokampal nöronlarda glutamin reseptörlerini inceeceğiz. Bu protokol, anajenik ekstrasellüler epitopa sahip herhangi bir proteine uyarlanabilir, eğer antikorlar yoksa, etiketli yapıların transveksiyonu hem etiketleme hem de spesifik mutasyonların incelenmesi için yararlı olabilir.
Örneklerimizde, endojen GluA1'e karşı antikorlar kullanıyoruz ve bu prosedürü B.To glu12 etiketli, kapak pilini parafin film kaplı tepsiye aktarıyoruz, reaktifleri kurtarıyoruz ve manipülasyonu kolaylaştırıyoruz. Kuluçka ve yıkama adımları için 37 santigrat derecede koşullandırılmış ortam kaydedin ve bakımını koruyun. Hücreleri, şartlı ortamda, oda sıcaklığında seyreltilmiş birincil antikorlarla 15 dakika kuluçkaya yatırın.
Bundan sonra, ortam içeren antikorları dikkatlice aspire etmek için bir vakum pipet kullanın ve hücreleri şartlı ortamla üç kez yıkayın. Eğer yüzey ve hücre içi reseptör ekspresyonu inceleniyorsa, metin protokolünde belirtildiği gibi, bu adımdan sonra hücreleri paraformaldehit ile düzeltin. Hücreleri antikorsuz koşullu ortamda koruyun ve içselleştirmeye olanak sağlamak için 37 derecede kuvöze geri verin.
İçselleştirme işlemini inceliyorsanız, metin protokolünde belirtildiği gibi, bu adımdan sonra hücreleri paraformaldehit ile düzeltin. Yüzeye bağlı birincil antikor üzerinde epitops bloke etmek için içselleştirilmemiş reseptörleri ifade reseptörleri ifade, konjuge edilmemiş Fab anti-IgG antikor parçaları ile inkübat hücreleri şartlı ortamda seyreltilmiş, oda sıcaklığında 20 dakika. Bundan sonra hücreleri şartlı ortamla üç kez yıkayın.
İçselleştirilmiş reseptörlerin geri dönüştürülmesine olanak sağlamak için yıkanmış kuyuları 37 derecede 80 mikromolar Dinamo içeren klimalı ortamla inkübe edin. Canlı hücrelerdeki modifikasyonları tamamladıktan sonra hücreleri pbs artı ile bir kez yıkayın. Hücrelere PBS'de %4 paraformaldehit ve %4 sakaroz çözeltisi ekleyin ve hücreleri düzeltmek için oda sıcaklığında yedi ila sekiz dakika boyunca bir duman kaputunda kuluçkaya yatırın.
Sonra hücreleri normal PBS ile üç kez yıkayın. PBS'deki %10 Normal Keçi Serumu çözeltisini hücrelere ekleyin ve spesifik olmayan bağlama bölgelerini engellemek için oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, primer antikor etiket reseptörlerini etiketlemek için, oda sıcaklığında PBS'de %3 NGS'de seyreltilmiş floresan etiketli ikincil antikorlu hücreleri bir saat boyunca kuluçkaya yatırın.
Bundan sonra hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Hücre içi reseptörleri etiketlemeye başlamak için, PBS'de %0.25 TritonX çözeltisi ekleyin ve hücreleri permeabilize etmek için 5 ila 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Sonra 30 dakika oda sıcaklığında% 10 NGS ile blok.
Yüzey ve total üzerinde çalışıyorsanız, hücre içi reseptörleri etiketlemek için, pbs%3 NGS ile seyreltilmiş, bir saat oda sıcaklığında, daha önce kullanılan aynı birincil antikor ile hücreleri kuluçka. Daha sonra hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. PBS'de %3 NGS'de seyreltilmiş ikinci floresan etiketli ikincil antikorlu etiket, oda sıcaklığında bir saat süreyle.
Bundan sonra pbs ile hücreleri üç kez yıkayın. Önce kapak fişleri yavaşça yerleştirin, hücre tarafı aşağı, hücreleri monte etmek için uygun montaj ortamının 12 ila 15 mikrolitre. Daha sonra hücreleri uygun konfokal mikroskopta görüntüleyin ve metin protokolünde belirtildiği gibi hücreleri analiz edin.
Glutamat reseptör ticaretini inceleyen bu protokol, hücre yüzeyinde ifade edilen reseptörlerin ve iç zarlarda ifade edilen lerin diferansiyel etiketlemesine dayanmaktadır. Konfokal görüntüleri elde ettikten sonra, floresan sinyal kolayca yüzey ekspresyonunda bir artış göstermek için ölçülebilir, hücre içi nüfusa göre, kimyasal LTP aşağıdaki. Plazma zarının bütünlüğünü gösteren, permeabilize olmayan hücrelerde PSD-95 için sinyal alınamaz.
Bu, glua1 yüzeyi için elde edilen sinyalin gerçekten yüzey ifade reseptörlerine karşılık geldiğini gösterir. Daha da önemlisi, içselleştirilmiş GluA1 için minimum sinyal, tüm yüzey epitoplarının antikor etiketlemenin ilk turu tarafından işgal edilmiş olduğunu gösteren, permeabilizasyon olmayan koşullar altında gözlemlenebilir. Daha sonra içselleştirilmiş reseptörler tanımlanır.
Bu örnek, S1480'deki GluN2B fosforilasyonun reseptör içselleşmesini desteklediğini vurgulamaktadır. Fosfomimetik mutant S1480E yabani tip reseptörlere göre çok daha yüksek bir içselleştirme oranı gösterdi. Beklendiği gibi, kontrolde içselleştirilmiş reseptörler için sinyal elde edilir.
Daha sonra, geri dönüşümlü reseptörler ve içselleştirilmiş reseptörler tanımlanır. Oluşturulan geri dönüşüm oranı, GluN2B S1480E'nin NMDAR geri dönüşümü üzerinde hiçbir etkisi olmadığını göstermektedir. Kontrolde, Fab engelleme yokluğunda glun2B ifade yüzey için güçlü bir sinyal görülebilir.
Bu sinyal Fab-tedavi kültürlerde kaybolur, engelleme protokolü tamamen yüzey imal epitopsblok için yeterli olduğunu gösteren, ve geri dönüşüm den sonra gözlenen yüzey sinyalleri gerçekten plazma membran geri ticareti reseptörlerine karşılık gelir. Mevcut protokol, yüzeyifade edilen proteinlerin düzenlenmesini incelemek için kullanılan yöntemlerden sadece biridir. Burada elde edilen verileri genişletmek veya doğrulamak için başka yaklaşımlar da alınabilir.
Biyosonyum, yaşam görüntüleme teknikleri veya elektrofizyoloji veya kalsiyum görüntüleme gibi fonksiyonel yaklaşımlar gibi biyokimyasal yöntemler bunlardır. Biz reseptörlerin lokalizasyondondurmak için PFA kullanın, Ancak PFA bilinen bir karsinojen, bu yüzden uygun PPE giyerken, bir duman başlık altında PFA kullanarak adımları gerçekleştirmek için çok önemlidir.
