外部刺激に対する細胞応答は、所定の瞬間に細胞表面上で発現されるタンパク質のセットに大きく依存します。したがって、その数、細胞内局在化、およびこれらのタンパク質のサブユニット組成は動的に制御される。ここでは、細胞培養における表面発現受容体のレベルを定量化する抗体供給アプローチを用い、内在化およびリサイクル再開を行う限り行う。
これは、表面発現タンパク質の調節の機械化情報を提供する非常に汎用性の高いプロトコルです。この例では、一次海馬ニューロンにおけるグルタミン受容体を研究します。このプロトコルは、アナジェニック細胞外エピトープを有するタンパク質に適合することができ、抗体が利用できない場合、タグ付き構築物のトランスベクションは、特定の突然変異の標識および研究の両方に有用であり得る。
我々の例では、内因性GluA1に対する抗体を使用し、タグ付きGlu12は、この手順を開始B.To、パラフィンフィルムカバートレイまでカバースリップセル側を転送し、試薬を保存し、操作を容易にします。インキュベーションと洗浄のステップのために摂氏37度で調整された媒体を保存し、維持する。条件培地で希釈した一次抗体を、室温で15分間インキュベートします。
この後、真空ピペットを使用して、培地を含む抗体を慎重に吸引し、細胞を調整された培地で3回洗浄します。表面対細胞内受容体発現を研究する場合、テキストプロトコルで概説したように、このステップの後にパラホルムアルデヒドで細胞を固定する。抗体を含まない状態の培地で細胞を維持し、37°Cでインキュベーターに戻して、内在化を可能にします。
内在化プロセスを研究する場合は、テキストプロトコルで概説されているように、このステップの後にパラホルムアルデヒドで細胞を固定します。表面に結合した一次抗体上のエピトープを遮断し、インターナライズされていない受容体を発現し、コンジュゲートされていないFab抗IgG抗体断片をコンジュゲートした状態で培養し、コンディションされた培地で希釈し、室温で20分間培養する。この後、条件を付けた培地で細胞を3回洗います。
洗浄されたウェルを、摂氏37度で80マイクロモルダイナソーレを含むコンディションされた培地でインキュベートし、内在型受容体のリサイクルを可能にする。生細胞の変更を終えた後、PBSプラスで細胞を一度洗います。4%パラホルムアルデヒドと4%スクロースの溶液をPBSに加え、室温で7〜8分間ヒュームフードでインキュベートし、細胞を固定します。
その後、通常のPBSで細胞を3回洗浄します。PBSに10%正常ヤギ血清の溶液を加え、室温で30分間インキュベートし、非特異的結合部位を遮断する。次に、PBSで3%NGSで蛍光タグ付き二次抗体を1時間室温で希釈して細胞をインキュベートし、一次抗体標識受容体を標識する。
この後、細胞をPBSで3回洗浄する。細胞内受容体の標識を開始するには、PBSに0.25%TritonXの溶液を加え、室温で5〜10分間インキュベートし、細胞を透過させる。その後、室温で10%NGSで30分間ブロックします。
表面対合計を研究する場合、細胞内の細胞を、以前に使用した同じ一次抗体で、PBSで3%NGSで希釈し、室温で1時間、細胞内受容体に標識する。次に、細胞をPBSで3回洗浄する。2番目の蛍光タグ付き二次抗体を用いた標識は、PBSで3%NGSで希釈し、室温で1時間希釈した。
この後、細胞をPBSで3回洗浄する。まず、カバースリップをセル側に、適切な取り付け媒体の12~15マイクロリットルにそっと置いて、セルを取り付けます。次に、適切な共焦点顕微鏡上の細胞を画像化し、テキストプロトコルに概説されているように細胞を分析します。
グルタミン酸受容体の密売を研究するこのプロトコルは、細胞表面で発現する受容体の差動標識に基づいて、および内部膜で発現するものである。共焦点画像を取得した後、蛍光シグナルを容易に定量することができ、細胞内集団に対して、化学的LTPに続く表面発現の増加を示すことができる。PSD-95のシグナルは、非透過細胞では得られないので、形質膜の完全性を示す。
これは、表面GluA1について得られたシグナルが実際に表面発現受容体に対応することを示す。重要なことに、非パーメアビライゼーション条件下で、非透過型GluA1の最小シグナルを観察することができ、すべての表面エピトープが抗体標識の最初のラウンドによって占められていることを示す。その後、内在化された受容体が同定される。
この例示は、S1480におけるGluN2Bリン酸化が受容体内在化を促進することを強調する。ホスホマイム変異体S1480Eとしては、野生型受容体と比較してはるかに高い内在化比を示した。予想通り、コントロール内の内在型受容体に対するシグナルは得られない。
次に、再生受容体と内在型受容体が同定される。生成されたリサイクル比は、GluN2B S1480EがNMDARリサイクルに影響を与えがないことを示しています。制御では、Fabブロッキングがない場合にGluN2Bを発現した表面に対して強いシグナルを観察することができる。
このシグナルはFab処理培養で消失し、ブロックプロトコルが表層を完全に遮断するのに十分であり、リサイクル後に観測された表面信号が実際に形質膜に戻って人身売買された受容体に対応していることを示している。現在のプロトコルは、表面発現タンパク質の調節を研究するために利用可能な方法の1つに過ぎません。ここで取得したデータを拡張または検証するには、他の方法を使用します。
これらには、生化学的方法、バイオチン化、生命イメージング技術、または電気生理学またはカルシウムイメージングのような機能的アプローチが含まれる。PFAを使用して受容体の局在を凍結しますが、PFAは既知の発がん性物質であるため、適切なPPEを着用しながら、ヒュームフードの下でPFAを使用してステップを実行することが重要です。
