تعتمد الاستجابات الخلوية للمحفزات الخارجية بشكل كبير على مجموعة البروتينات التي يتم التعبير عنها على سطح الخلية في لحظة معينة. وبناء على ذلك، يتم التحكم بشكل حيوي في عدد هذه البروتينات، وتوطينها تحت الخلوية، وتكوينها الفرعي. هنا، سوف نستخدم نهج تغذية الأجسام المضادة لتحديد مستوى المستقبلات السطحية التي أعرب عنها في الثقافات الخلية، طالما أن استئناف استيعاب وإعادة التدوير.
هذا هو بروتوكول تنوعا للغاية، التي توفر معلومات ميكانيكية لتنظيم البروتينات السطحية أعرب. في مثالنا، سوف ندرس مستقبلات الجلوتامين في الخلايا العصبية فرس النهر الأولية. يمكن تكييف هذا البروتوكول مع أي بروتين يمتلك epitope خارج الخلية، إذا لم تكن الأجسام المضادة متوفرة، يمكن أن يكون transvection من التشييد الموسومة مفيدة لكل من وضع العلامات ودراسة طفرات محددة.
في الأمثلة لدينا، ونحن نستخدم الأجسام المضادة ضد GluA1 الذاتية، والموسومة Glu12 B.To تبدأ هذا الإجراء، ونقل غطاء زلات الجانب الخلية تصل إلى علبة غلاف الفيلم غطت، لحفظ الكواشف، وتسهيل التلاعب. حفظ وصيانة وسائل الإعلام مكيفة في 37 درجة مئوية للحضانة والخطوات الغسيل. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية المخففة في وسائل الإعلام مكيفة، في درجة حرارة الغرفة، لمدة 15 دقيقة.
بعد ذلك، استخدم ماصة فراغ لpirate بعناية قبالة الأجسام المضادة التي تحتوي على وسائل الإعلام، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع وسائل الإعلام مكيفة. إذا دراسة سطح مقابل التعبير مستقبلات داخل الخلايا إصلاح الخلايا مع paraformaldehyde بعد هذه الخطوة، كما هو مبين في بروتوكول النص. الحفاظ على الخلايا في وسائل الإعلام مكيفة دون الأجسام المضادة، وإعادتها إلى الحاضنة في 37 درجة مئوية للسماح لادعاب.
إذا كان دراسة عملية استيعاب، إصلاح الخلايا مع شبه شكلي بعد هذه الخطوة، كما هو موضح في بروتوكول النص. لمنع epitopes على الأجسام المضادة الأولية تعلق على السطح عن المستقبلات التي لم يتم استيعابها، احتضان الخلايا مع شظايا الأجسام المضادة مضادة فاب غير مُجَنَّد IgG المخففة في وسائل الإعلام المُكيفة، لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بغسل الخلايا ثلاث مرات بوسائط مكيفة.
احتضان الآبار المغسولة مع وسائل الإعلام مكيفة تحتوي على 80 Dynasore micromolar، في 37 درجة مئوية، للسماح لإعادة تدوير المستقبلات الداخلية. بعد الانتهاء من التعديلات على الخلايا الحية، وغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني زائد. إضافة حل من 4٪ شبهformaldehyde و 4٪ السكروز في برنامج تلفزيوني للخلايا، واحتضان في غطاء محرك الدخان في درجة حرارة الغرفة لمدة سبع إلى ثماني دقائق، لإصلاح الخلايا.
ثم غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني العادية. إضافة حل من مصل الماعز العادي 10٪ في برنامج تلفزيوني إلى الخلايا، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، لمنع مواقع الربط غير محددة. المقبل، احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية الموسومة الفلورسنت مخففة في 3٪ NGS في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، لتسمية مستقبلات التسمية الأجسام المضادة الأولية.
بعد هذا، قم بغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. للبدء في وضع العلامات على مستقبلات داخل الخلايا، إضافة محلول من 0.25٪ TritonX في برنامج تلفزيوني، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس إلى 10 دقائق، ل Permeabilize الخلايا. ثم كتلة مع 10٪ NGS في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
إذا دراسة السطح مقابل المجموع، احتضان الخلايا مع نفس الأجسام المضادة الأولية المستخدمة سابقا، مخففة مع 3٪ NGS في برنامج تلفزيوني، في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، لتسمية مستقبلات داخل الخلايا. بعد ذلك، قم بغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. تسمية مع ثاني fluorescently الموسومة الأجسام المضادة الثانوية، المخفف في 3٪ NGS في برنامج تلفزيوني، في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
بعد هذا يغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. أولاً بلطف وضع زلة الغطاء، الجانب الخلية إلى أسفل، على 12 إلى 15 ميكرولترات من وسائل الإعلام تركيب المناسبة لتركيب الخلايا. ثم صورة الخلايا على المجهر confocal المناسبة، وتحليل الخلايا كما هو مبين في بروتوكول النص.
ويستند هذا البروتوكول لدراسة الاتجار بمستقبلات الغلوتامات على العلامات التفاضلية للمستقبلات، التي يتم التعبير عنها على سطح الخلية، وتلك التي يتم التعبير عنها في الأغشية الداخلية. بعد الحصول على الصور confocal، يمكن قياس إشارة الفلورسنت بسهولة لإظهار زيادة في التعبير السطحي، نسبة إلى السكان داخل الخلايا، بعد LTP الكيميائية. لا يمكن الحصول على أي إشارة ل PSD-95 في الخلايا غير مُمَيَّلة، مما يدل على سلامة غشاء البلازما.
هذا يشير إلى أن الإشارة التي تم الحصول عليها لسطح GluA1 يتوافق في الواقع إلى مستقبلات سطح أعرب. الأهم من ذلك، يمكن ملاحظة إشارة أدنى لـ GluA1 الداخلية في ظل ظروف غير الحساسية، مما يدل على أن جميع الظهاريات السطحية مشغولة بالجولة الأولية من وضع العلامات على الأجسام المضادة. ثم يتم تحديد المستقبلات التي تم استيعابها.
ويبرز هذا المثال أن فسفورة GluN2B في S1480 يعزز استيعاب المستقبلات. كما phosphomimetic متحولة S1480E عرض نسبة استيعاب أعلى بكثير مقارنة مع مستقبلات من نوع البرية. كما هو متوقع، يتم الحصول على أي إشارة لمستقبلات داخلي في عنصر التحكم.
بعد ذلك، يتم تحديد المستقبلات المعاد تدويرها والمستقبلات الداخلية. وتبين نسبة إعادة التدوير المتولدة أن GluN2B S1480E ليس لها أي تأثير على إعادة تدوير NMDAR. في عنصر التحكم، يمكن ملاحظة إشارة قوية لسطح أعرب GluN2B في غياب حظر فاب.
وتختفي هذه الإشارة في الثقافات المعالجة من قبل فاب، مما يدل على أن بروتوكول الحجب يكفي لحجب السطح المعبر عنه تماماً، وأن الإشارات السطحية التي لوحظت بعد إعادة التدوير تتوافق بالفعل مع المستقبلات التي يتم الاتجار بها مرة أخرى إلى غشاء البلازما. البروتوكول الحالي هو مجرد واحدة من الطرق المتاحة لدراسة تنظيم البروتينات السطحية المعبر عنها. ويمكن اتباع نهج أخرى لتوسيع نطاق البيانات التي تم الحصول عليها هنا أو التحقق منها.
وتشمل هذه الطرق البيوكيميائية، مثل البيوتينيل، تقنيات تصوير الحياة، أو النهج الوظيفية، مثل الفيزيولوجيا الكهربائية أو تصوير الكالسيوم. نحن نستخدم PFA لتجميد توطين المستقبلات ، ومع ذلك فإن PFA مادة مسرطنة معروفة ، لذلك من المهم تنفيذ الخطوات باستخدام PFA تحت غطاء الدخان ، مع ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
