本程序的总体目标是为制备具有附加特性（如水溶性或细胞靶向能力）的光卡化合物提供一种实用方法。使用简单的合成程序，该技术可用于将实验室扩展到笼中化合物上，并在不影响光敏性的情况下制造具有附加特性的笼状化合物。这种合成可以在标准实验室中进行，因为我们的可点击的笼式化合物在非核嗜酸性有机溶剂（如二氯甲烷或二甲基硫化物）中溶解时，可稳定进行光辐射。
与佐佐木弘一一起演示手术的将是后科医生铃木秋叶，原木和来自实验室的研究生井上裕久。首先将709.6毫克的paBhc甲醇和397.6毫克的n-碳二甲醚加入30毫升的圆底烧瓶中。将干六毫升二氯甲烷加入烧瓶中，并在环境温度下搅拌溶液一小时。
在孵育结束时，加入342.8毫克4-二甲基苯丙胺和552微升的三丁基六甲基甲酸酯，并在环境温度下搅拌溶液3小时。然后在真空下使用旋转蒸发器去除溶剂和其他挥发性材料，并使用硅胶闪光柱色谱直接净化残留物。要将功能单元安装到可点击的笼中，在 10 毫升离子交换水中溶解 249 毫克铜二硫酸盐，以提供 0.1 摩尔硫酸铜溶液。
溶解8毫克的两个主要paBhc模拟帕利塔塞尔，7.5毫克三叶（3-羟基丙酮）胺， 162.4毫克的钠-l-抗坏血酸，和3.1毫克的15-氯-3，6，9-三氧五基二氮在混合溶剂中，含有2.5毫升0.1摩尔磷酸酯缓冲液和0.5毫升二甲基硫化物。接下来，在反应混合物中加入81.2微升0.1摩尔硫酸铜溶液，并在环境温度下搅拌混合物80分钟，用HPLC监测反应的进度。在反应结束时，用 75% 乙酰硝酸水溶液的 3.5 毫升溶液解决沉淀物，并直接将所得溶液应用到半制备 HPLC 系统中，以净化所需的产品。
对于量子效率测量，在荧光灯覆盖的紫外光切断过滤器下，用 10 毫升 KMOPS 缓冲液稀释 10 微升二甲基硫化物中的样品库存溶液。将溶液的等分转移到化学行为计的光反应中使用的同一试管中。用 350 纳米光照射样品溶液 5 秒钟，定期从辐照溶液中去除 50 微升等同素，供 HPLC 进行分析。
然后确定以秒为单位的辐照时间，其中 90% 的起始材料通过拟合起始材料的时间依赖消失图进行反应。对于可单击的笼复合物的 HaloTag 配体定位，使用适当的细胞分离试剂收获感兴趣的目标细胞群，并在每毫升 DMEM 浓度的 2.5 倍至第五细胞中重新悬浮细胞。然后将每盘约10至第5个细胞播种到35毫升玻璃底盘中，在37摄氏度和5%的二氧化碳下进行过夜孵育。
第二天早上，在含有700微升的血清介质的1.5毫升微离心管中稀释14微克PC DNA三光表皮生长因子受体血浆DNA。接下来，在减少血清介质的 150 微升中加入 5 微升的唇部分培养试剂，使管在环境温度下站立 5 分钟。在孵育结束时，将150微升稀释的血浆DNA加入每个稀释的唇部分液试剂样品中，并在环境温度下再孵育样品5分钟。
在孵育结束时，每盘用两毫升PBS冲洗细胞，并添加1.5毫升的减少血清培养剂。在每个培养皿中加入150个质粒唇膜分培养物复合物的微升，并将细胞返回细胞培养箱48小时。在孵育结束时，吸上超级纳酸，并添加一毫升新鲜准备的DMEM，并辅以两个微摩尔paBhc十六进制光晕到每道菜。
在37摄氏度下30分钟后，吸气含有笼中化合物的介质，用一毫升PBS加洗两次细胞，去除任何未绑定的化合物。在每个培养皿中加入500微升的减少血清培养基，并将细胞返回细胞培养箱再进行30分钟，以去除进入细胞的化合物。在孵育结束时，用每盘一毫升PBS加一毫升的PBS加一毫升冲洗细胞，并添加一毫升的介质，每次培养中不添加无酚红色。
然后通过激光扫描共声荧光显微镜记录荧光图像。对于使用可点击的保持复合物对激酶定位进行光介质调制，每 35 毫升玻璃底盘在 Ham F12 介质的两毫升中播种约 5 倍 10 至第五 TOC-A-1 细胞。第二天，将GP二西利西罗醇激酶伽马的质粒编码转染细胞48小时，正如刚刚证明的。
转染结束后，用两毫升的血清介质代替转染上流因。在37摄氏度和5%的二氧化碳下，在细胞中加入20微升100倍paBhcAA工作溶液，进行5至60分钟的孵育。在孵化结束时，将培养皿放在装有双光源荧光照明器的倒置荧光显微镜的客观阶段。
每10秒对细胞进行10分钟的成像，同时根据实验协议在适当的实验时间点照射细胞和波长。使用这种方法，如证明，可点击的笼中化合物的一些生物有趣的分子，包括帕利塔塞尔和阿拉奇多酸，可以成功地合成。其他特性，如水溶性和细胞定位能力，可以通过铜催化循环点击反应引入到paBhc模拟帕利塔塞尔。
然后，这些可单击的笼式帕利塔塞尔可以进行光化，在350纳米的辐照后产生其父化合物。可点击的笼状化合物的物理和光化学特性见表。在活细胞实验中，paBhc六角基光对培养的哺乳动物细胞的目标，瞬时表达一种哈洛标记蛋白和表皮生长因子受体，从而从细胞膜上的荧光素莫蒂PAHBHC六角体光晕中引出绿色荧光信号。
此外，CHO-K1细胞的治疗暂时表达GP二甲酸激酶伽马与阿拉奇多酸导致二甲醇激酶伽马的亚细胞定位调制。在紫外线照射后，在paBhc-AA处理的细胞中也观察到二甘油激酶伽马定位的类似变化。在水溶液中进行加热实验时，确保始终在具有短波长度封盖滤光片的荧光灯下工作。
按照此过程，您可以研究由于缺乏水溶性、膜渗透性或细胞靶向能力而大量用于生物实验的笼中化合物。
