使用由内皮结肠形成细胞和间质干细胞形成的共培养球体的三维血管生成测定系统

这个3D共培养球体系统旨在模仿生理血管生成。它将有效地评估潜在的血管生成调节器，并在体内研究之前提供可预测的信息。该系统利用由两个血管祖细胞形成的共培养球体，可用于研究细胞相互作用、发芽和生理血管发生管成熟。

如果我们能使用患者细胞形成共培养球体，我们可以利用这个系统开发个性化的治疗异常血管生成相关疾病，如癌症。该测定系统可提高血管生成和药物开发研究的敏感性和效率。首先使用05%trypsin-EDTA将ECFC和MSC分别从80至90%的汇合细胞培养中分离三到五分钟。

用新鲜完整的DMEM培养基灭活尝试曲，并移液细胞几次，产生单个细胞悬浮液。通过离心收集细胞，然后用无血清介质洗两次。第二次洗涤后，将ECFC稀释至每毫升中浓度的3倍10至6个细胞，将MSC稀释至每毫升两毫升微离心管中每毫米中浓度的2倍至6个细胞。

通过离心来培养细胞，并小心地从每个细胞样本中吸出除了最后15至25微升的上经剂。接下来，从荧光染料试剂盒中重新悬浮250微升稀释剂C中的每个颗粒，并轻轻移液细胞悬浮液，以确保完全分散。将 250 微升新鲜准备好的 20 微摩尔 PKH67 添加到 ECFC 的管中。

在 MSCs 的管中加入 250 微升 12 微摩尔 Pkh26。立即混合两个细胞悬浮液。在室温下5分钟后，在震动下，防止光线，停止染色过程，每管0.5毫升FBS孵育一分钟。

在孵化结束时，通过离心收集细胞，并小心地去除上经剂，然后每次洗涤两毫升新鲜完整介质中洗两次。然后将细胞悬浮在15毫升管中。对于球类生成，第二次洗涤后，首先稀释细胞悬浮液在适当浓度内皮细胞生长介质MV2中，辅以20%甲基纤维素溶液和5%胎儿牛血清浓度。

接下来，将每个细胞悬浮液添加到灭菌的聚苯乙烯矩形储液罐中。使用多通道移液器将大约 125 微升的细胞液滴添加到 150 毫米培养板的封面上。添加所有细胞后，将盖子倒置在含有 15 毫升 PBS 的培养皿底部，并在细胞培养培养箱中放置板 24 小时。

第二天，用五毫升PBS将盘子盖冲洗成每盘50毫升的管子。用额外的五毫升 PBS 冲洗盖，收集任何剩余的球体，然后通过离心对球体进行颗粒状。小心丢弃所有，但最后100至200微升的上流液，并轻轻地敲按管壁，使球体自由悬浮在剩余的上流液。

添加适当的体积内皮细胞生长介质MV2，辅以5%胎儿牛血清和40%甲基纤维素溶液到每个管，以每毫升100球体中等浓度重新分配球体。使用直径为 3 到 5 毫米的一毫升移液器尖端轻轻混合球形悬浮液。使用新的宽尖、一毫升移液器，将球状悬浮液与中和 I 型胶原蛋白凝胶混合，在冰上以一对一的比例使用。

将每种球体悬浮胶原蛋白凝胶溶液的 900 微升添加到预热的 24 孔板的孔中。允许悬浮液在细胞培养培养箱中聚合30分钟，然后用100微升内皮细胞生长介质MV2覆盖球体，每毫升VEGF补充2.5%FBS和50毫微克，仅ECFC球类和中微量仅对MSC和ECFC+MSC球体培养剂进行补充。然后将每个板放在安装在细胞培养培养箱中的实时细胞记录器中，并随机聚焦在 10 倍放大的 5 到 10 个球形上，以每小时 24 小时监控每个荧光标记球体的发芽形成。

要量化球体发芽，请将图像文件导入 ImageJ，并测量每个实验组从五个随机选择的球体中表达适当荧光信号的芽的数量和长度。对于ECFC加MSC球体，芽数和累积芽长度明显高于所有时间点的仅ECFC球类。仅 MSC 球体不会形成芽，但演示了 MSC 在球体之外的单独迁移。

ECFC与绿色荧光染料和MSC与红荧光染料在结合产生ECFC-plus-MSC球体之前的标签表明，ECFC中端的芽结构被MSC覆盖，表明结合的MSC在芽形成过程中作为血管周围细胞发挥作用，通过两个血管细胞之间的紧密关联来增强芽的稳定性和耐久性。与控制ECFC加-MSC球体相比，使用血管生成抑制剂预处理的ECFC加MSC球体以剂量依赖的方式显示芽数和累积芽长度的减少。在平行实验中，ECFC只用抑制剂预处理的球体，然后用VEGF刺激，也表明生长因子引起的芽数和累积芽长度以剂量依赖的方式减少。

值得注意的是，与仅ECFC的球类相比，需要更高的血管生成抑制剂浓度来抑制ECFC加MSC球体。与控制治疗动物和低剂量血管生成抑制剂治疗动物相比，在高剂量血管生成抑制剂治疗的动物中，肿瘤生长在人类异种移植肿瘤小鼠模型中受到显著抑制。高剂量治疗小鼠的贝瓦西祖马布血浆浓度为每毫升568正负40.62微克，接近贝瓦西祖马布的IC50值，用于抑制ECFC-plus-MSC球体的累积发芽长度，而不是仅ECFC类球体。

这表明ECFC加-MSC共培养球类系统适合在动物研究之前预测有效的血浆浓度。使用宽尖、一 mL 移液器在冰上胶原蛋白凝胶中轻轻混合球类，对于保护球体的完整性非常重要。我们可以修改这个系统来引入其他细胞类型，如免疫细胞和其他细胞外基质，以研究血管生成期间的细胞-矩阵串扰。