Эта 3D-ко-культурная сфероидная система предназначена для имитации физиологического ангиогенеза. Он будет эффективен для оценки потенциальных ангиогенных модуляторов и предоставляет предсказуемую информацию до начала исследований vivo. Эта система использует со-культурные сфероиды, образованные двумя сосудистыми клетками-предшественниками, и может быть использована для исследования клеточных взаимодействий, прорастания и трубчатого созревания физиологического ангиогенеза.
Если мы можем использовать клетки пациентов для формирования сфероидов совместной культуры, мы можем использовать эту систему для разработки персонализированных методов лечения аномальных заболеваний, связанных с ангиогенезом, таких как рак. Эта система анализа может повысить чувствительность и эффективность исследований ангиогенеза и разработки лекарственных препаратов. Начните с использования 05%трипсина-ЭДТА, чтобы отделить ECFCs и MSCs от 80 до 90% слияние клеточных культур в течение трех или пяти минут в инкубаторе клеточной культуры, соответственно.
Инактивировать трипсин со свежей полной среде DMEM, и пипетки клетки несколько раз для создания одной клеточной подвески. Соберите клетки путем центрифугации, а затем две моет с сывороткой свободной среде. После второй стирки разбавляют ECFCs в три раза от 10 до шести клеток на миллилитр средней концентрации и MSCs в два раза от 10 до шести клеток на миллиметр средней концентрации в отдельных двухмиллилитровых микроцентрифуг труб.
Пеллет клетки центрифугации, и тщательно аспирировать все, кроме последних 15 до 25 микролитров супернатанта из каждого образца клетки. Далее, повторно использовать каждую гранулу в 250 микролитров разбюант C из флуоресцентного красителя комплект, и осторожно пипетки подвески клетки для обеспечения полного дисперсии. Добавьте 250 микролитров свежеприготовленных 20-микромоляных PKH67 в трубку ECFCs.
Добавьте 250 микролитров 12-микромолярной PKH26 в трубку MSCs. Немедленно смешайте обе клеточные суспензии. Через пять минут при комнатной температуре при тряске, защищенной от света, остановите процесс окрашивания с минутой инкубации в 0,5 миллилитров FBS на трубку.
В конце инкубации, собирать клетки центрифугации, и тщательно удалить супернатант, а затем два моет в двух миллилитров свежей полной среды на стирку. Затем приостанавливать клетки в соответствующей среде в 15-миллилитровых трубках. Для генерации сфероидов, после второй стирки, сначала разбавляют клеточные суспензии в соответствующей концентрации эндотелиального роста клеток среднего MV2, дополненного 20%метил-целлюлозным раствором и 5%фетальной концентрацией сыворотки крупного рогатого скота.
Затем добавьте каждую клеточную суспензию в стерилизованный полистирол прямоугольный резервуар. Используйте многоканальный пипетку, чтобы добавить примерно 125-микролитровые капли клеток на крышку 150-миллиметровой пластины культуры. Когда все клетки были добавлены, инвертировать крышку над дном блюдо, содержащее 15 миллилитров PBS, и поместить пластины в инкубатор культуры клеток в течение 24 часов.
На следующий день, промыть блюдо охватывает с пятью миллилитров PBS в одну 50-миллилитровую трубку на блюдо. Промыть крышки с дополнительными пятью миллилитров PBS для сбора любых оставшихся сфероидов, и гранулы сфероидов центрифугации. Тщательно отбросьте все, кроме последних 100 до 200 микролитров супернатанта, и аккуратно нажмите на стену трубки так, чтобы сфероиды свободно подвешены в оставшемся супернатанте.
Добавьте соответствующий объем эндотелиального роста клеток среднего MV2, дополненного 5%фетальной сывороткой крупного рогатого скота и 40%метил-целлюлозным раствором для каждой трубки для повторного перерасхода сфероидов на 100 сфероидов на миллилитр средней концентрации. Используйте одномиллилитровый наконечник пипетки, разрезанный до диаметра от трех до пяти миллиметров, чтобы аккуратно смешать суспензии сфероидов. Используйте новый ширококоротый одноми миллилитровый пипетку, чтобы смешать раствор суспензии сфероидов с нейтрализованным коллагеновым гелем типа I при соотношении один к одному на льду.
Добавьте 900 микролитров каждого раствора коллагенового геля сфероида в колодцы предварительно разогретой пластины из 24 скважин. Разрешить подвески для полимеризации в течение 30 минут в инкубаторе клеточной культуры, прежде чем покрыть сфероиды с 100 микролитров эндотелиальных клеток роста среднего MV2 дополнены 2,5%FBS и 50 нанограмм на миллилитр VEGF для ECFC только сфероиды и средние дополнены FBS только MSC и ECFC-плюс-MSC spheroid культур. Затем поместите каждую пластину в регистратор клеток в режиме реального времени, установленный в инкубаторе культуры клеток, и случайным образом сосредоточьтесь на пяти-10 сфероидах при 10-м увеличении, чтобы контролировать образование прорастания каждого флуоресценции сфероида каждый час в течение 24 часов.
Для количественной оценки прорастания сфероидов импортируют файлы изображений в ImageJ и измеряют количество и длину ростков, выражают соответствующий флуоресцентный сигнал от пяти случайно выбранных сфероидов на экспериментальную группу. Для сфероидов ECFC-plus-MSC количество ростков и кумулятивная длина ростков значительно выше по сравнению с сфероидами ecFC во все моменты времени. Сфероиды MSC не образуют ростки, но демонстрируют индивидуальную миграцию MSC вне сфероидов.
Маркировка ECFC с зелено-флуоресцентным красителем и MSC с краснофлуоресцентным красителем перед объединением для генерации сфероидов ECFC-плюс-MSC демонстрирует, что структуры ростков, опосредованные ECFC, покрыты MSCs, предполагая, что комбинированные MSCs функционируют как перивазкулярные клетки во время образования ростков, повышая стабильность ростков и долговечность тесной ассоциации между двумя сосудистыми клетками. СФЕРоиды ECFC-plus-MSC, предварительно обработанные ингибитором ангиогенеза, показывают снижение количества ростков и кумулятивную длину ростков в дозе зависимой манере по сравнению с контролем сфероидов ECFC-plus-MSC. В параллельных экспериментах, ECFC только сфероиды предварительно лечение с ингибитором следуют стимуляции с VEGF также демонстрируют снижение фактора роста индуцированного числа ростков и кумулятивной длины ростка в дозе зависимой образом.
Следует отметить, что более высокая концентрация ингибитора ангиогенеза необходима для ингибирования сфероидов ECFC-плюс-MSC по сравнению с сфероидами только ДЛЯ ECFC. Рост опухоли значительно ингибируется в высокой дозе ингибитора ангиогенеза обработанных животных по сравнению с контрольно-обработанных животных и низкой дозы ингибитора ангиогенеза обработанных животных в человеческой модели ксенотрансплантата опухоли мыши. Концентрация плазмы bevacizumab в высоких дозах обработанных мышей было 568 плюс или минус 40,62 микрограмм на миллилитр, который был ближе к IC50 значение bevacizumab для ингибирования кумулятивной длины ростка в ECFC-плюс-MSC сфероидов, а не ECFC только сфероиды.
Это говорит о том, что со-культурная сфероидная система ECFC-plus-MSC подходит для прогнозирования эффективных концентраций плазмы до начала исследования на животных. Использование широкого наконечника, один-МЛ пипетки мягко смешивать сфероиды, пока они находятся в коллагенового геля на льду имеет важное значение для защиты целостности сфероидов. Мы можем изменить эту систему, чтобы ввести другие типы клеток, таких как иммунные клетки и другие внеклеточные матрицы для исследования клеточной матрицы перекрестного времени во время ангиогенеза.
