מערכת ספרואידית תלת מימדית זו נועדה לחקות אנגיוגנזה פיזיולוגית. זה יהיה יעיל להערכת אפנן אנגיוגני פוטנציאלי ומספק מידע צפוי מראש של מחקרי vivo. מערכת זו משתמשת בספירואידים של תרבות-חיים שנוצרו על-ידי שני תאי גוף וסקולריים ובאפשרותך להשתמש בהם כדי לחקור אינטראקציות תאיות, נבטים והתבגרות צינורית של אנגיוגנזה פיזיולוגית.
אם אנחנו יכולים להשתמש בתאי המטופל כדי ליצור כדוריות שיתוף תרבות, אנחנו יכולים להשתמש במערכת זו כדי לפתח טיפולים מותאמים אישית עבור מחלות הקשורות אנגיוגנזה חריגה, כגון סרטן. מערכת זו assay יכול להגביר את הרגישות והיעילות של מחקרים של אנגיוגנזה ופיתוח תרופות. התחל בשימוש ב- 05%trypsin-EDTA כדי לנתק ECFCs ו- MSCs מ- 80% עד 90% תרבויות תאים קונפלנטיות למשך שלוש או חמש דקות ב חממה לתרבות תאים, בהתאמה.
השבת טריפסין עם מדיום DMEM שלם טרי, ו pipette התאים כמה פעמים כדי ליצור השעיה תא יחיד. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, ואחריו שתי שטיפות עם מדיום ללא סרום. לאחר הכביסה השנייה, לדלל את ECFCs לשלוש פעמים 10 לשישה תאים למיליליטר של ריכוז בינוני MSCs ל 2 פעמים 10 לשישה תאים למילימטר של ריכוז בינוני בצינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים שני מיליליטר.
גלולה התאים על ידי צנטריפוגה, בזהירות לשאוף את כל אבל האחרון 15 כדי 25 microliters של supernatant מכל דגימת תא. לאחר מכן, יש לעכל כל גלולה ב-250 מיקרוליטרים של DILUENT C מערכת צבע פלואורסצנטי, ולפעום בעדינות את מתלי התא כדי להבטיח פיזור מלא. הוסיפו 250 מיקרוליטרים של PKH67 20 מיקרומולרים טריים לצינור של ECFCs.
הוסף 250 microliters של PKH26 12 מיקרומולרי לצינור של MSCs. מיד לערבב את שני מתלי התא. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר עם רעידות, מוגן מפני אור, לעצור את תהליך הכתם עם דגירה של דקה אחת ב 0.5 מיליליטר של FBS לצינור.
בסוף הדגירה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, בזהירות להסיר את supernatant, ואחריו שתי שטיפות בשני מיליליטר של מדיום שלם טרי לכל לשטוף. ואז להשעות את התאים במדיום בהתאמה בצינורות 15 מיליליטר. עבור דור כדורית, לאחר הכביסה השנייה, תחילה לדלל את מתלי התא בריכוז המתאים של צמיחת תא אנדותל בינוני MV2 בתוספת 20% פתרון תאית מתיל ו 5% ריכוז סרום חזיר עוברי.
לאחר מכן, הוסף כל מתלה תא לתוך מאגר מלבני פוליסטירן מעוקר. השתמש פיפטה רב ערוצית להוסיף כ 125-microliter טיפות של תאים על המכסה של צלחת תרבות 150 מילימטר. כאשר כל התאים נוספו, להפוך את הכיסוי על החלק התחתון של צלחת המכילה 15 מיליליטר של PBS, ולמקום את הצלחות באינקובטור תרבות התא במשך 24 שעות.
למחרת, לשטוף את המנה מכסה עם חמישה מיליליטר של PBS לתוך צינור אחד 50 מיליליטר לכל מנה. לשטוף את הכיסויים עם חמישה מיליליטר נוספים של PBS כדי לאסוף את כל כדוריות שנותרו, ו גלולה את הכדורים על ידי צנטריפוגה. השלך בזהירות את כל 100 עד 200 המיקרוליטרים האחרונים של על-טבעי, והקש בעדינות על קיר הצינור כך שהספרואידים יושעו בחופשיות בשארית העל-טבעית.
הוסף את הנפח המתאים של צמיחת תא אנדותל בינוני MV2 בתוספת 5% סרום חזיר עוברי ו 40% מתיל תאית פתרון לכל צינור כדי resuspend את הספרואידים ב 100 כדוריות למיליליטר של ריכוז בינוני. השתמשו בקצה פיפיטר של מיליליטר אחד שנחתך לקוטר של שלושה עד חמישה מילימטרים כדי לערבב בעדינות את המתלים הספרואידיים. השתמשו בפיפיטה רחבה ומיליליטר חדשה כדי לערבב את תטגם המתלים של הכדוריד עם ג'ל קולגן מסוג מנוטרל ביחס של אחד לאחד על קרח.
הוסיפו 900 מיקרוליטרים של כל תוסף ג'ל קולגן תלוי ספרואיד לתוך בארות של צלחת 24 בארות מחוממת מראש. אפשר להשעיות לעשות פולימריזציה במשך 30 דקות בהטמית תרבות התאים, לפני כיסוי הספרואידים עם 100 microliters של צמיחת תא אנדותל בינוני MV2 בתוספת 2.5%FBS ו 50 ננוגרם למיליליטר של VEGF כדי כדוריות ECFC בלבד ובינוני בתוספת FBS רק לתרבויות כדורי MSC ו ECFC פלוס MSC. לאחר מכן מניחים כל צלחת במקליט תאים בזמן אמת המותקן באינקובטור של תרבות התאים, ומתמקדים באופן אקראי בחמישה עד עשרה כדורי עופרואידים בהגדלה של פי 10 כדי לפקח על היווצרות הנבטים של כל ספרואיד עם תווית פלואורסצנטיות כל שעה במשך 24 שעות.
כדי לכמת את הנבטים הכדוריים, יבא את קובצי התמונה ל- ImageJ, ולמדוד את מספר ואורך הנבטים המבטאות את אות הפלואורסצנט המתאים מחמישה כדורי ספורואידים שנבחרו באקראי לכל קבוצת ניסוי. עבור כדוריות ECFC פלוס-MSC, מספר הנבטים ואורך הנבט המצטבר גבוהים משמעותית בהשוואה לאלה של כדוריות ECFC בלבד בכל נקודות הזמן. MSCs בלבד כדוריות אינן יוצרות נבטים אלא מדגימות הגירה אינדיבידואלית של MSC מחוץ לספרואידים.
התיוג של ECFC עם צבע ירוק-פלואורסצנטי ו- MSC עם צבע פלואורסצנטי אדום לפני השילוב כדי ליצור כדוריות ECFC פלוס MSC מדגים כי מבני נבטים מתווכים ECFC מכוסים MSCs, מה שמרמז כי MSCs משולב לתפקד כתאים perivascular במהלך היווצרות נבטים, שיפור יציבות נבט ועמידות על ידי הקשר ההדוק בין שני תאים כלי דם. כדוריות ECFC פלוס-MSC מטופלים מראש עם מעכב אנגיוגנזה להראות מספר נבט ירד ואורך נבט מצטבר באופן תלוי מינון בהשוואה לשליטה ECFC פלוס MSC כדוריות. בניסויים מקבילים, כדוריות ECFC בלבד מטופלים מראש עם המעכב ואחריו גירוי עם VEGF גם להדגים מספר נבט גורם גדילה ירידה ואורך נבט מצטבר באופן תלוי מינון.
שימו לב, יש צורך בריכוז גבוה יותר של מעכב אנגיוגנזה כדי לעכב כדורי עופרואידים ECFC פלוס-MSC בהשוואה לספרואידים ECFC בלבד. גידול הגידול מעוכב באופן משמעותי בבעלי חיים שטופלו במעכבי אנגיוגנזה במינון גבוה בהשוואה לבעלי חיים שטופלו בשליטה ובעלי חיים שטופלו במעכבי אנגיוגנזה במינון נמוך במודל עכבר גידול קסנוגרפט אנושי. ריכוז הפלזמה של bevacizumab בעכברים במינון גבוה שטופלו היה 568 פלוס או מינוס 40.62 מיקרוגרם למיליליטר, שהיה קרוב יותר לערך IC50 של אוואצומפ לעיכוב אורך נבט מצטבר בספירואידים ECFC פלוס-MSC ולא כדוריות ECFC בלבד.
הדבר מצביע על כך שמערכת הכדורידים השותף של ECFC פלוס MSC מתאימה לחיזוי ריכוזי פלזמה יעילים לקראת מחקר בבעלי חיים. שימוש פיפטה רחב קצה, אחד מ"ל לערבב בעדינות את הכדורואידים בזמן שהם בג'ל קולגן על קרח חשוב להגנה על שלמות הכדורואידים. אנחנו יכולים לשנות את המערכת הזאת כדי להציג סוגי תאים אחרים כגון תאים חיסוניים מטריצות חוץ תאיות אחרות כדי לחקור crosstalk מטריצת התא במהלך אנגיוגנזה.
